Ex vivo Imaging av T-celler i murina Slices lymfkörtel med Widefield och Confocal Mikroskop

1. Förbereda skivor från lymfkörtlar Förbered en 4% låg smältpunkt agaroslösningen för inbäddning. Späd agaros i PBS och mikrovågsugn denna lösning. När agarosen helt upplöst, underhålla lösningen vid 37 ° C tills redo att användas. Förbered en 6-brunnar vävnadskultur. Tillsätt 1,1 ml RPMI komplett odlingsmedium per brunn, och sätt in en organotypic filter i varje brunn. Placera 6-brunnar vid 4 ° C tills att överföra skivor. Placera brickor av rostfritt stål, med inre diameter 4 mm, i en plast skål fylld med RPMI komplett medium. Brickor kommer ytterligare att användas för att koncentrera cellerna på vibratome skär skiva. Sacrifice musen i enlighet med lokala föreskrifter djurskydd. Ta försiktigt bort perifera lymfkörtlar från den omgivande vävnaden och placera dem i en plast skål med iskallt PBS. Man måste vara försiktig med att inte skada strukturen lymfkörtel, eftersom dessa organ är mycket mjuka. Häll 4%-agarosgel i en 35-mm plast skålen och fint överför noderna i gelen. Lämna agarosgel på is i 5 min för att härda. Ta bort blocket från skålen och trimma agar för att lämna 3-5 mm gel runt varje lymfkörtel. Fäst inbäddade noder på provet disken i vibratome med giftfria vävnad lim. Installera provet skivan i facket fylls med iskall PBS. § den agar-inbäddade vävnaden vid 320 ìm tjocklek med vibratome hastigheten inställd på en långsam rad (0,3 mm / s) och vibrationsfrekvens inställt på en medeldistans (1,5 mm). Försiktigt överföra skivor lymfkörtel som de skärs upp på organotypic kultur skären med fin pincett. Placera 3 skivor på varje insats. Använd stor försiktighet eftersom skivor kan lätt skadas. En typisk perifer lymfkörtel kommer att ge 5 § Vid ett snitt på 320 ìm. Kasta den första och sista skivor, eftersom de endast innehåller ytliga vävnad. Placera rostfria brickor på varje enskild skiva. Se brickor är väl positionerade på agarosen omgivande vävnaden. Inkubera kultur plattan vid 37 ° C i en 5% CO 2 fuktas inkubator tills den ska tallrik T-celler. 2. Isolera T-celler från noder mus lymfan Isolera T-celler i enlighet med tidigare publicerade JUPITER artikel 3. Använd T-celler omedelbart och fortsätt till nästa avsnitt. Annars kan lymfocyter odlas över natten i komplett RPMI-mediet kompletteras med 10 ng / ml IL-7. 3. Märkning av isolerade T-celler Tvätta cellerna i HBSS. Resuspendera dem på samma buffert på 10 x 10 6 per ml. Tillsätt samma volym HBSS innehåller 1 mikroM Cell Tracker gröna CMFDA ger en slutlig koncentration av 0,5 mikroM. Inkubera cellsuspensionen vid 37 ° C under 5 min. Tvätta cellerna två gånger med komplett RPMI-medium. Resuspendera cellerna i en slutlig koncentration på 10 x 10 6 per ml i komplett RPMI-medium. Dessa är märkta celler kommer att klädd på skivor. Andra fluorescerande färger än CMFDA kan användas också, men tänk på att dessa molekyler är potentiellt toxiskt över vissa koncentrationer. 4. Plätering märkta T-celler på skivor lymfkörtel Avlägsna överskott av medel i den inre delen av brickan med en pipett. Låt inte vävnaden ska bli torra, arbeta snabbt under detta steg. Försiktigt avstå från 10 till 20 l märkta T-celler som motsvarar 1 till 2 x 10 5 celler i den inre delen av brickan. Man måste vara försiktig att inte vidröra vävnaden med spetsen på pipetten. Var noga med att nedgången cellsuspension sitter på plats. Lägg skivor med cellerna i inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2 i minst 30 min för att lymfocyter att migrera i vävnaden. 5. Imaging T-celler i skivor lymfkörtel I denna video-artikeln, vi bilden fluorescerande T-celler i skivor lymfkörtel med en widefield inverterat mikroskop och en konfokala upprätt mikroskop. Ställ in temperaturen vid 37 ° C. Vår mikroskop är utrustade med temperaturkontrollerad kammare. Installera en genomblödning som gör det möjligt kontinuerlig perfusion av lymfkörteln slice med syresatt (5% CO 2, 95% O 2) fenolrött-fri RPMI medium. I vårt system går perfusion medier i bildbehandling kammaren från ena sidan av tyngdkraften. Mediet sugs med en pump kopplad till en insamling av avfall kolv. Ställ in media flödet till 1 ml / min. Med fin pincett, försiktigt ta ut bit från 6-brunnar och doppa beredningen i uppvärmda syresatt RPMI medium för ett par sekunder för att bli av fluorescerande celler inte infiltreras i vävnaden. ImaGing T-celler med ett brett fält inverterat mikroskop Placera skiva upp och ner på en skräddarsydd imaging kammare som består av nylon trådar limmas på den inre delen av ett glas botten maträtt. I denna kammare, nylon trådar lyfta bit från glaset och göra det möjligt syresatta lösningen att sprida i vävnaden. Detta är nödvändigt som T cell migration i lymfkörtlar är starkt beroende av syre. Säkra skiva genom att lägga in det en rostfri bricka. Under dessa förhållanden ligger skiva några mikrometer över botten på skålen, vilket underlättar förnyelse av perfusion lösningen. För att fånga ett stort synfält (800 x 800 ìm, ungefär en tredjedel av nodens slice yta), samla in bilder med hjälp av en 10x torrt objektiv. Vi fann att 10x Nikon S fluor 0,5 NA var mest lämpade för våra analyser. Ett typiskt tidsförlopp imaging experiment fångar 5 optisk plan som spänner över ett djup av 50 ìm i axiell (z) dimension. Fluorescerande T-celler är oftast avbildade med intervaller på mellan 10 till 30 sekunder under 10 till 20 min. Imaging T-celler med en konfokala upprätt mikroskop Den konfokalmikroskop i detta protokoll är en Leica SP5 utrustad med en 20x nedsänkning i vatten mål (Olympus, 20x/0.95 NA). Säkra segmentet till avbildning skede av mikroskop. Observera: Vi brukar placera en bricka på förberedelserna för att immobilisera den. Ställ en avbildning session genom att samla in en serie bilder längs z-axeln. Till celler bilden T i en intakt vävnad struktur, är i startläge vanligtvis 5 till 10 mikrometer under den märkta första T cell. 6. Representativa resultat Genom att följa denna video-protokollet bör du räkna med att visualisera ett stort antal fluorescerande T-celler ansamlas i T-zonen i nod, ett fenomen som normalt förekommer i denna speciella miljö in vivo (figur 1). I synnerhet bör T-celler uteslutas från B-celler zoner, som oftast precis under kapseln. Ett lyckat experiment kommer också att resultera i T-cellerna rekryteras i vävnaden (figur 2) och visar en mycket rörliga beteende (Figur 3) överensstämmer med publicerade resultat som erhållits i intakt lymfkörtlar 4. I genomsnitt bör medelhastigheten för enskilda T celler i skivor vara nära 10 mikrometer / min (Figur 4). Figur 1. T-celler ansamlas i en lymfkörtel skiva. Fluorescerande-märkta T-celler (CMFDA, grön) lades till en lymfkörtel skiva 30 min före Image Acquisition (övre bilden). Bilden är den högsta projektion av 5 bilder som spänner över 50 nm i z-riktningen. Det ljusa fältet bilden visas i botten. Bilderna var tagna med en widefield mikroskop. Figur 2. T-celler rekryteras till en lymfkörtel skiva. Fluorescerande-märkta T-celler (CMFDA, grön) lades till en lymfkörtel skiva 30 min före bildtagning med en konfokalmikroskop. Bilderna var tagna vid snittytan (övre bilden) och 40 ìm nedan (nedre bilden). Figur 3. T-celler är mycket rörliga i en lymfkörtel skiva. Fluorescerande-märkta T-celler var avbildas under 12 min med en widefield mikroskop. Banor av enskilda T celler visas som färgkodade låtar för att representera större förskjutningar från blått (låg rörliga celler) till rött (hög rörliga celler). Spår har beräknats med hjälp av Imaris programvara. Den vita linjen följer kanten av noden, medan den streckade ovalen avgränsar den förmodade zon B cell. Figur 4. Inom en lymfkörtel skiva, är T-cell hastighet nära 10 mikrometer / min. Hastigheterna beräknades med hjälp Imaris programvara från spår representerade i figur 3.