Widefield और confocal सूक्ष्मदर्शी के साथ murine लसीका नोड स्लाइसें में टी कोशिकाओं की पूर्व vivo इमेजिंग
Summary
इस प्रोटोकॉल छवि फ्लोरोसेंट टी कोशिकाओं लसीका नोड स्लाइस में शुरू करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. तकनीक पारंपरिक widefield प्रतिदीप्ति या confocal सूक्ष्मदर्शी के साथ टी सेल प्रवास की वास्तविक समय विश्लेषण परमिट.
Abstract
भोले टी कोशिकाओं को लगातार परिधीय लिम्फ नोड्स, दुर्लभ व्यक्त एंटीजन का पता लगाने सहित माध्यमिक lymphoid अंगों, यातायात. लिम्फ नोड्स में टी कोशिकाओं के प्रवास एक जटिल प्रक्रिया है जो दोनों सेलुलर और रासायनिक कारकों chemokines सहित शामिल है. हाल ही में, दो photon माइक्रोस्कोपी के उपयोग बरकरार लिम्फ नोड्स में टी कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए और अन्य कक्षों के साथ उनके व्यवहार और उनकी बातचीत पर कुछ मात्रात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए अनुमति दी है. जबकि वहाँ vivo प्रणाली में एक स्पष्ट लाभ कर रहे हैं, इस दृष्टिकोण एक जटिल और महंगी इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता है और ऊतकों को सीमित पहुँच प्रदान करता है है . Murine लिम्फ नोड्स के भीतर टी कोशिकाओं के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए, हम एक टुकड़ा 1 परख, मूल neurobiologists द्वारा स्थापित और murine thymus 2 के लिए हाल ही में transposed विकसित किया है. इस तकनीक में, fluorescently लेबल टी कोशिकाओं एक तीव्रता से तैयार लसीका नोड टुकड़ा के शीर्ष पर चढ़ाया जाता है. इस वीडियो लेख में, स्थानीयकरण और ऊतकों में टी कोशिकाओं के प्रवास एक widefield और एक confocal खुर्दबीन के साथ वास्तविक समय में विश्लेषण कर रहे हैं. तकनीक है जो vivo में दो photon माइक्रोस्कोपी छवि टी कोशिकाओं को उनके प्राकृतिक वातावरण में एक प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करता है और टी सेल प्रवास अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट पूरक.
Protocol
Discussion
हम लसीका नोड स्लाइस, जो शुरू की टी कोशिकाओं के व्यवहार की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है पैदा करने के लिए एक सरल, त्वरित और मजबूत तकनीक वर्णित है. हाल के वर्षों में, इस पद्धति को लागू किया गया है सफलतापूर्वक thymic और लसीका नोड स्लाइस का उपयोग करने के लिए बाह्य कारकों को नियंत्रित टी सेल स्थिति और 1,5 गतिशीलता की पहचान. यह भी सकारात्मक चयन के दौरान और प्रतिजन मान्यता 2,6 पर टी कोशिकाओं में किया गया है thymocytes में Ca 2 + प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया. उपरिशायी टुकड़ा परख कि चर्चा के काबिल हो फायदे और सीमाएं प्रस्तुत करता है. ध्यान से, इस प्रणाली के ऊतकों को पहुँच परमिट, उपयोगी है अगर एक की जरूरत है स्लाइस में हेरफेर करने के लिए pharmacologically क्रम में सेल प्रवास की आणविक नियंत्रण के साथ हस्तक्षेप. बाद इमेजिंग के लिए, स्लाइस immunohistochemistry के लिए संसाधित किया जा सकता है संरचनाओं कि imaged किया गया है के बारे में अधिक जानकारी इकट्ठा. इसके अलावा, प्रेक्षण एक पारंपरिक widefield प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के साथ किया जा सकता है. हालांकि एक confocal या दो photon एक खुर्दबीन के साथ के रूप में अच्छा संकल्प और नहीं है कि phototoxicity सिद्धांत रूप में है एक फोटोन के साथ दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ तुलना में अधिक गंभीर है, यह सादगी के लाभ, एक कम लागत, और बड़ा विकल्प है उत्तेजना तरंगदैर्य.
एक अक्षुण्ण लिम्फ नोड में टी कोशिकाओं की इमेजिंग लेबल लिम्फोसाइटों के अंतःशिरा इंजेक्शन की आवश्यकता है बाद में lymphoid अंगों के लिए घर है कि. जैसा कि हम एक पहले से पता चला है, टुकड़ा परख दत्तक हस्तांतरण प्रयोग के साथ पूरी तरह से संगत है. हालांकि, लिम्फ नोड्स में घर के लिए टी कोशिकाओं के लिए आवश्यक समय की लंबाई फ्लोरोसेंट रंजक है कि समय के साथ कोशिकाओं के बाहर रिसाव की प्रवृत्ति है का उपयोग जटिल हो सकता है. यह 2 Ca + डाई fura-2 के मामले है. ऊतक में टी कोशिकाओं का तेजी से भर्ती (<30 मिनट) के साथ, टुकड़ा परख ऐसे रंगों का उपयोग करने का अवसर प्रदान करता है. अंत में, इस विधि महान कई मानव ऊतकों में टी सेल कार्यों का विश्लेषण का लाभ रखा जिंदा है.
यह प्रायोगिक प्रणाली भी कि सीमाओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए प्रस्तुत करता है. टुकड़ा करने की क्रिया के साथ जुड़े नुकसान की कटौती की सतह के निकट ऊतक के सतही क्षेत्र में विशेष रूप से टी सेल कामकाज को प्रभावित कर सकता है. आदेश में टुकड़ा के भीतर कोशिका मृत्यु का आकलन करने के लिए, हम फ्लोरोसेंट डाई SYTOX हरे रंग की है कि समझौता प्लाज्मा झिल्ली के साथ कोशिकाओं प्रवेश किया है. हमारे प्रयोगों से पता चलता है कि कुल नोडल कोशिकाओं, ज्यादातर ऊतक के सतही क्षेत्र में स्थानीयकृत है, के बारे में 20% fluorescently इस परमाणु डाई के साथ लेबल रहे थे. परख के साथ एक अन्य संभावित चिंता स्लाइस chemokines सहित महत्वपूर्ण घुलनशील कारकों को बनाए रखने की क्षमता है. हालांकि, हम कोई संकेत नहीं है कि हमारे डेटा को इस तरह की समस्याओं से प्रभावित थे, के बाद से टी कोशिकाओं टुकड़ा के भीतर एक अच्छा गतिशीलता प्रदर्शन किया है, हम स्वस्थ कटौती की सतह से microns के कई दसियों में स्थित क्षेत्रों में इमेजिंग टी कोशिकाओं के महत्व पर जोर करना चाहते हैं. जबकि, यह इस प्रोटोकॉल में जैसे पारंपरिक सूक्ष्मदर्शी (widefield या confocal) के साथ किया जा सकता है है, यह संभावना है कि लसीका नोड टुकड़ा तैयारी दो photon इमेजिंग गहराई में स्थानिक संकल्प में वृद्धि और phototoxicity कम हो जाएगा के साथ संयुक्त.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों डॉ. एलेन Trautmann जो हमें लसीका नोड स्लाइस प्रदर्शन करने के लिए प्रोत्साहित किया धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के हिस्से में लीग Nationale Contre ले कैंसर, Fondation डालना ला Recherche MEDICALE एन फ्रांस और एसोसिएशन डालना ला सभ्य सुर ले कैंसर से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Fine Forceps | World Precision Instruments | 14142 | |
| 30 mm Culture inserts | Millipore | PICM0RG50 | |
| RPMI | Invitrogen | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
| Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
| Stainless steel washers, 4 mm of inner diameter | DIY store | ||
| Cell Tracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 |
Referências
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