Ex-vivo-Imaging von T-Zellen in Murine Lymph Node Slices mit Weitfeld und konfokale Mikroskope

1. Vorbereitung Scheiben von Lymphknoten Bereiten Sie eine 4% niedriger Schmelzpunkt Agarose-Lösung für die Einbettung. Verdünnen Agarose in PBS und Mikrowelle dieser Lösung. Wenn der Agarose vollständig gelöst ist, warten die Lösung bei 37 ° C bis zur Verwendung. Bereiten Sie eine 6-well Gewebekulturplatte. Fügen Sie 1,1 ml RPMI komplettem Kulturmedium pro Vertiefung, und fügen Sie ein organotypischen Filter in jede Vertiefung. Legen Sie die 6-Well-Platte bei 4 ° C bis zu seiner Scheiben übertragen. Legen Sie Unterlegscheiben aus Edelstahl, mit einem Innendurchmesser von 4 mm, in einer Plastikschale mit RPMI komplett gefüllt ist. Unterlegscheiben weiter verwendet werden, um die Zellen auf der Vibratom Anschnitt zu konzentrieren. Sacrifice der Maus in Übereinstimmung mit den örtlichen Tierschutzvorschriften. Entfernen Sie vorsichtig den peripheren Lymphknoten aus dem umgebenden Gewebe und legen Sie sie in einer Plastikschale mit eiskaltem PBS. Es ist darauf zu achten, dass die Lymphknoten Struktur beschädigt werden, da diese Organe sehr weich sind. Gießen Sie die 4%-igen Agarosegel in eine 35-mm-Kunststoff-Schale und zart Übertragung der Knoten in das Gel. Lassen Sie das Agarosegel auf Eis für 5 min zu verhärten. Entfernen Sie den Block aus der Schale und schneiden Sie die Agar um 3-5 mm Gel um jeden Lymphknoten zu verlassen. Befestigen Sie den eingebetteten Knoten auf der Probe Festplatte des Vibratom mit ungiftigen Gewebekleber. Installieren Sie die Probe Festplatte in das Fach mit eiskaltem PBS gefüllt. Section der Agar-eingebetteten Gewebe bei 320 mu m Dicke mit dem Vibratom Geschwindigkeit auf einem langsamen Bereich eingestellt (0,3 mm / s) und die Schwingungsfrequenz auf einem mittleren Bereich (1,5 mm) eingestellt. Sorgfältig Transfer Lymphknoten Scheiben, wie sie sein auf der organotypischen Kultur Inserts mit feinen Pinzetten geschnitten werden. Platz 3 Scheiben auf jeder Einsatz. Seien Sie sehr vorsichtig, als Scheiben leicht beschädigt werden kann. Eine typische periphere Lymphknoten wird Ausbeute 5 Abschnitte, wenn sie bei 320 um geschnitten. Entsorgen Sie die erste und letzte Scheiben, als sie enthalten nur oberflächliche Gewebe. Legen Sie Unterlegscheiben aus Edelstahl auf jedem einzelnen Stück. Stellen Sie sicher, Unterlegscheiben sind auf dem Agarose umgebende Gewebe positioniert. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C in einer 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bis ready-to-Plate-T-Zellen. 2. Isolating T-Zellen aus der Maus Lymphknoten Isolieren T-Zellen nach dem zuvor veröffentlichten JoVE Artikel 3. Verwenden Sie T-Zellen sofort und gehen zum nächsten Abschnitt. Andernfalls könnte Lymphozyten über Nacht in komplettem RPMI-Medium mit 10 ng / ml IL-7 ergänzt kultiviert werden. 3. Kennzeichnung von isolierten T-Zellen Wash-Zellen in HBSS. Resuspendieren sie in dem gleichen Puffer bei 10 x 10 6 pro ml. Fügen Sie das gleiche Volumen HBSS mit 1 uM Zelle Tracker grünen CMFDA eine endgültige Konzentration von 0,5 uM. Inkubieren Sie die Zellsuspension bei 37 ° C während 5 min. Wash Zellen zweimal mit komplettem RPMI-Medium. Die Zellen in einer Endkonzentration von 10 x 10 6 pro ml in komplettem RPMI-Medium. Diese markierten Zellen werden auf die Scheiben beschichtet werden. Andere fluoreszierende Farbstoffe als CMFDA könnte auch genutzt werden, aber bedenken Sie, dass diese Moleküle potentiell toxischen oberhalb bestimmter Konzentrationen sind. 4. Plating markierten T-Zellen auf Lymphknoten-Scheiben Entfernen Sie überschüssiges Medium in den inneren Teil der Scheibe mit einer Pipette enthalten. Nicht in das Gewebe trocken werden, die Arbeit schnell bei diesem Schritt. Gently verzichten 10 bis 20 ul markierten T-Zellen, die 1 bis 2 x 10 5 Zellen in den inneren Teil der Scheibe entspricht. Vorsicht ist geboten, um das Gewebe mit der Spitze der Pipette berühren. Achten Sie darauf, dass der Rückgang der Zellsuspension in Ort und Stelle bleibt. Legen Sie die Schnitte mit Zellen im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 für mindestens 30 min, damit Lymphozyten in das Gewebe zu migrieren. 5. Imaging-T-Zellen im Lymphknoten Scheiben In diesem Video-Beitrag, wir Bild fluoreszierenden T-Zellen in Lymphknoten Scheiben mit einem Weitfeld inversen Mikroskop und einem konfokalen Mikroskop aufrecht. Stellen Sie die Temperatur bei 37 ° C. Unsere Mikroskope sind mit kontrollierter Temperatur Kammern ausgestattet. Installieren Sie eine Perfusion System ermöglicht kontinuierliche Perfusion des Lymphknotens Scheibe mit Sauerstoff (5% CO 2, 95% O 2) Phenolrot-freiem RPMI-Medium. In unserem System gibt perfundierten Medien in der Imaging-Kammer von einer Seite durch die Schwerkraft. Das Medium wird mit einer Pumpe verbunden zu einer Sammelstelle Kolben gesaugt. Legen Sie die Medien Durchfluss auf 1 ml / min. Mit feinen Pinzette vorsichtig herausnehmen Scheibe aus dem 6-Well-Platte und tauchen die Vorbereitung in erwärmt Sauerstoff RPMI-Medium für ein paar Sekunden, um loszuwerden, fluoreszierende Zellen nicht in das Gewebe infiltriert. ImaGing T-Zellen mit einem Weitwinkel-inversen Mikroskop Platzieren Sie die Scheibe nach oben auf eine maßgeschneiderte Imaging Kammer, die von Nylonfäden auf den inneren Teil einer Glasboden Teller geklebt besteht. In dieser Kammer, heben die Nylonfäden die Scheibe aus dem Glas und aktivieren Sie die Sauerstoff-Lösung in das Gewebe diffundieren. Dies ist erforderlich, da T-Zell-Migration in den Lymphknoten ist stark abhängig von Sauerstoff. Befestigen Sie die Scheibe, indem auf sie ein Edelstahl-Unterlegscheibe. Unter diesen Bedingungen liegt die Scheibe wenige Mikrometer über dem Boden der Schale, die Erneuerung der Perfusionslösung erleichtert. Um eine Aufnahme zu großes Sehfeld (800 x 800 um etwa ein Drittel des Knotens Scheibenoberfläche), sammeln Sie Bilder mit einem 10x-Objektiv trocken. Wir fanden, dass die 10x Nikon S fluor 0,5 nA am besten geeignet für unsere Analysen war. Ein typisches Zeitraffer-Imaging-Experiment erfasst 5 optischen Flächen überspannt eine Gesamttiefe von 50 um in axialer (z) Dimension. Fluorescent T-Zellen sind in der Regel in Abständen zwischen 10 bis 30 Sekunden, während 10 bis 20 min belichtet. Imaging-T-Zellen mit einem konfokalen Mikroskop aufrecht Das konfokale Mikroskop im Sinne dieses Protokolls ist ein Leica SP5 mit einem 20x Wasser Immersionsobjektiv (Olympus, 20x/0.95 NA) ausgestattet. Befestigen Sie die Scheibe auf die Bildgebung des Mikroskops. Hinweis: Wir in der Regel statt einer Scheibe auf die Vorbereitung, um es zu fixieren. Set ein bildgebendes Sitzung durch das Sammeln von einer Reihe von Bildern entlang der z-Achse. Um Bild-T-Zellen in intaktem Gewebe-Struktur, ist die Startposition in der Regel bei 5 bis 10 mu m unterhalb der ersten markierten T-Zellen gesetzt. 6. Repräsentative Ergebnisse Durch Einhalten dieses video-Protokoll sollten Sie erwarten, dass eine große Anzahl von fluoreszierenden T-Zellen in der T-Zone des Knotens, ein Phänomen, das normalerweise in diesem besonderen Umfeld, in vivo (Abbildung 1) angesammelt zu visualisieren. Insbesondere sollte T-Zellen aus B-Zell-Zonen, die in der Regel sind nur unter der Kapsel ausgeschlossen werden. Ein erfolgreiches Experiment wird auch in T-Zellen in das Gewebe (Abbildung 2) rekrutiert Ergebnis und zeigt eine sehr bewegliche Verhalten (Abbildung 3) im Einklang mit publizierten Ergebnissen in intakten Lymphknoten 4 erhalten. Im Durchschnitt sollte die mittlere Geschwindigkeit der einzelnen T-Zellen innerhalb von Scheiben in der Nähe von 10 pm / min (Abbildung 4). Abbildung 1. T-Zellen reichern sich in einem Lymphknoten in Scheiben schneiden. Fluoreszenzmarkierten T-Zellen (CMFDA, grün) zu einem Lymphknoten Scheibe 30 min vor der Bildaufnahme (Bild oben) wurden hinzugefügt. Das Bild ist die maximale Projektion von 5 Bilder für mehr als 50 mu m in z-Richtung. Die Hellfeldbild ist in unten dargestellt. Die Bilder wurden mit einem Weitfeld-Mikroskop aufgenommen. Abbildung 2. T-Zellen werden in einem Lymphknoten Scheibe rekrutiert. Fluoreszenzmarkierten T-Zellen (CMFDA, grün) zu einem Lymphknoten Scheibe 30 min vor der Bildaufnahme mit einem konfokalen Mikroskop wurden hinzugefügt. Die Bilder wurden an der Schnittfläche (Bild oben) und 40 um unten (Bild unten) erfasst. Abbildung 3. T-Zellen sind sehr beweglich in einem Lymphknoten in Scheiben schneiden. Fluoreszenzmarkierten T-Zellen während 12 min mit einem Weitfeld-Mikroskop wurden abgebildet. Flugbahnen der einzelnen T-Zellen werden als farbcodierte Tracks angezeigt zu erhöhen Verschiebungen von blau (geringe bewegliche Zellen) bis rot (hoch bewegliche Zellen) repräsentieren. Tracks wurden mit Imaris Software. Die weiße Linie folgt der Kante des Knotens, während die gestrichelten Oval begrenzt die vermeintliche B-Zell-Zone. Abbildung 4. Innerhalb einer Lymphknoten-Scheibe, wird die T-Zell-Geschwindigkeit in der Nähe von 10 pm / min. Die Geschwindigkeiten wurden mit Imaris Software von Tracks in Abbildung 3 dargestellt.