التصوير خارج الحي من خلايا تي في الفئران شرائح العقدة الليمفاوية مع Widefield ومجاهر متحد البؤر
Summary
يصف هذا البروتوكول وسيلة لخلايا T الفلورسنت عرض الصور الى شرائح العقدة الليمفاوية. هذه التقنية تسمح في الوقت الحقيقي والتحليلات للهجرة الخلايا التائية مع مضان widefield التقليدية أو المجاهر مبائر.
Abstract
الخلايا التائية السذاجة المرور بشكل مستمر لأجهزة اللمفاوية الثانوية ، بما في ذلك الغدد الليمفاوية الطرفية ، لكشف المستضدات النادرة التي أعرب عنها. الهجرة من خلايا تي في الغدد الليمفاوية هو عملية معقدة تنطوي العوامل الخلوية والكيميائية بما في ذلك chemokines. في الآونة الأخيرة ، سمح استخدام اثنين من الفوتون المجهري لتعقب الخلايا التائية في الغدد الليمفاوية وسليمة للحصول على بعض المعلومات الكمية على سلوكهم وتفاعلها مع الخلايا الأخرى. في حين أن هناك مزايا واضحة الى النظام في الجسم الحي ، وهذا النهج يتطلب أجهزة معقدة ومكلفة ، ويوفر فرص محدودة في الأنسجة. لتحليل سلوك الخلايا التائية داخل الغدد الليمفاوية الفئران ، وضعنا مقايسة شريحة 1 ، وضعه في الأصل من قبل علماء بيولوجيا الأعصاب ونقلها مؤخرا إلى التوتة الفئران 2. في هذه التقنية ، يتم مطلي الخلايا التائية fluorescently المسمى على أعلى شريحة العقدة اللمفية مستعدة تماما. في هذه المقالة عن طريق الفيديو ، ويتم تحليل والتوطين والهجرة من خلايا تي في الأنسجة في الوقت الحقيقي مع widefield ومبائر المجهر. الأسلوب الذي يكمل في الجسم الحي اثنين الفوتون المجهري يقدم نهجا فعالا لخلايا T صورة في بيئتها الطبيعية ، وتوضيح الآليات الكامنة وراء الهجرة تي الخلية.
Protocol
Discussion
وقد وصفت لدينا مباشرة ، وتقنية سريعة وقوية لتوليد شرائح العقدة الليمفاوية ، والتي تستخدم للتحقيق في سلوك الخلايا التائية قدم. في السنوات الأخيرة ، وقد تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح باستخدام التوتة وشرائح العقدة الليمفاوية لتحديد العوامل خارج الخلية السيطرة على الخلية وتحديد المواقع تي 1،5 حركية. كما تم استخدامه لقياس الكالسيوم 2 + الردود في أثناء اختيار thymocytes إيجابية في الخلايا التائية وعند الاعتراف مستضد 2،6. وفحص شريحة تراكب يقدم مزايا والقيود التي تستحق أن تناقش. من الملاحظة ، وهذا النظام يسمح بالوصول إلى الأنسجة ، مفيدة إذا كان أحد يحتاج إلى معالجة شرائح عقاقيري من أجل التدخل في مكافحة الهجرة الجزيئي للخلايا. بعد التصوير ، ويمكن معالجة المناعية للشرائح لجمع مزيد من المعلومات عن الهياكل التي تم تصويرها. وعلاوة على ذلك ، يمكن إجراء المراقبة مع المجهر مضان widefield التقليدية. رغم ان القرار ليست جيدة كما مع مبائر أو مجهر ثنائي الفوتون ، وأنه من حيث المبدأ الضيائية أكثر شدة مع فوتون واحد من اثنين مع المجهري الفوتون ، لها مزايا البساطة ، وأقل تكلفة ، وأكبر الاختيار موجات من الإثارة.
التصوير من خلايا تي في العقدة الليمفاوية سليمة يتطلب الحقن في الوريد من الخلايا الليمفاوية المسمى ذلك المنزل في وقت لاحق إلى الأجهزة اللمفاوية. كما بينا سابقا 1 ، وفحص شريحة متوافقة تماما مع تجربة نقل بالتبني. ومع ذلك ، يمكن لطول الفترة الزمنية اللازمة للخلايا T إلى منزل في الغدد الليمفاوية تعقيد استخدام الأصباغ الفلورية التي لديها ميل إلى تسرب الخلايا مع مرور الوقت. هذا هو حال كا 2 + صبغ fura – 2. مع توظيف سريع (<30 دقيقة) من خلايا تي في النسيج ، وفحص شريحة يوفر فرصة لاستخدام هذه الأصباغ. أخيرا ، فإن هذا الأسلوب له ميزة كبيرة لتحليل وظائف الخلية تي في الأنسجة البشرية عدة أبقى على قيد الحياة.
ويعرض هذا النظام التجريبي أيضا القيود التي تحتاج إلى أن توضع في الاعتبار. قد يؤدي إلى تلف المرتبطة تشريح تؤثر T أداء الخلية ، وخصوصا في المنطقة السطحية من الأنسجة بالقرب من سطح قطع. من أجل تقييم موت الخلايا داخل شريحة ، وقد استخدمنا الفلورية الخضراء SYTOX الصبغة التي تخترق خلايا غشاء البلازما مع خطر. تجاربنا التي كانت تكشف عن fluorescently المسمى حوالي 20 ٪ من مجموع الخلايا العقدية ، مترجمة في معظمها في المنطقة السطحية من الأنسجة ، وهذه الصبغة النووية. قلق آخر محتمل مع مقايسة هو قدرة الشرائح على الاحتفاظ بما في ذلك العوامل الهامة للذوبان chemokines. على الرغم من أنه ليس لدينا أي دليل على أن تأثرت البيانات المتوفرة لدينا من مشاكل من هذا النوع منذ الخلايا التائية عرض حركية جيدة داخل شريحة ، نود أن نؤكد على أهمية الخلايا T التصوير في المناطق الصحية التي تقع في عشرات ميكرون من سطح قطع. في حين ، ويمكن القيام بذلك مع المجاهر التقليدية (أو widefield مبائر) في مثل هذا البروتوكول ، فمن المرجح أن شريحة العقدة الليمفاوية إعداد مجتمعة مع اثنين من الفوتون التصوير سوف يزيد من عمق في التحليل المكاني والحد من الضيائية.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور آلان تراوتمان الذي شجعنا على أداء شرائح العقدة الليمفاوية. وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من الدوري الفرنسي لمكافحة السرطان الوطني كونتر جنيه ، ومؤسسة بحوث من أجل لا ميديكال ان فرنسا وتصب جمعية بحوث السرطان لا سور جنيه.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Fine Forceps | World Precision Instruments | 14142 | |
| 30 mm Culture inserts | Millipore | PICM0RG50 | |
| RPMI | Invitrogen | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
| Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
| Stainless steel washers, 4 mm of inner diameter | DIY store | ||
| Cell Tracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 |
Referências
- Asperti-Boursin, F. CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner. J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. , (2007).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1869 (2002).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-986 (2009).
- Gollmer, K. CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway. Blood. 114, 580-580 (2009).
