Подготовка E18 корковых нейронов крысы за раздробленности в микрожидкостных устройств

Подготовка E18 плода крысы корковых нейронов для фрагментации Прежде чем начать, важно, чтобы согреть все необходимые средства массовой информации и реагенты до 37 ° C. Важно также, чтобы стерилизовать все, что используется для приготовления клеток (например, резиновые луковицы, трубки стеллажи, средств массовой информации бутылки и т.д.), и то, что помещается в капот, путем протирания вниз с 70% этанола. Положите два куска E18 плода Cortex Крыса (один мозг, ранее расчлененных) в 15 мл пробирку, содержащую 1 мл ледяной кальция без магния без буфера рассечение. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина-EDTA в кору головного мозга в рассечение буфера, в результате чего конечный объем до 2 мл и конечной концентрации трипсина до 0,125%. Место 15 мл трубки в 37 ° С водяной бане в течение 8 минут. За это время огонь польский 3 стакана Пастера пипец, образуя последовательно меньшие отверстия, в кабинете биологической безопасности, чтобы помочь сохранить стерильность. После 8 минут инкубации коры, добавьте 10 мл DMEM, содержащей 10% FBS в кору головного мозга, чтобы помочь остановить трипсина реакции. Центрифуга 15 мл пробирку коры и DMEM/10% ЭТС при 2500 оборотов в минуту в течение 2 минут. В кабинете биобезопасности, удалить супернатант из коры использованием пипетки Пастера стекла с вакуумной всасывания прилагается. Будьте осторожны, чтобы не нарушить или выбить гранул. Добавить 1 мл NMB в кору головного мозга гранул и осторожно пипеткой вверх и вниз. Это очень важно, чтобы избежать создания пузырьков воздуха в то время как pipeting вверх и вниз, как пузырьки воздуха могут повредить клетки в результате окисления. Используйте огневой полировкой пипетки Пастера с самой широкой открытости измельченного в порошок коры путем присоединения стерильные резиновые лампы до конца и pipeting вверх и вниз 5 раз, опять же будьте осторожны, чтобы не вводить пузырьков воздуха. Продолжайте этот процесс с другими 2 пипец стекла, каждый из которых снизилась открытия размера. После растирания, центрифуги вниз клетки снова при 2500 оборотов в минуту в течение 2 минут. После центрифугирования, еще раз удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 2 мл НБМ. Фильтры ресуспендировали решение клетки через 45 мкм фильтр клетки. Пятно клеток с Трипановый Синий, посчитали, и загружаются в устройства. Как правило, мы нагрузка 20 мкл клеток на устройстве. Примечание: Конечная концентрация клеток, как правило, от 2,5 млн. кл / мл и 8 миллионов клеток / мл Загрузка клетки После клетки были пересчитаны, пришло время для загрузки клеток в устройстве: Принесите заранее подготовленные устройств, содержащих НБМ в кабинет биобезопасности для поддержания стерильности. Удалите излишки средств массовой информации из скважин путем вакуумного всасывания. Однако, будьте осторожны, чтобы избежать удаления всех средств массовой информации – должны быть некоторые средства массовой информации в основном канале. Применяют 20 мкл клеток в левый верхний резервуар руку устройства (см. схему при необходимости). Клетки впадают в устройство и подключить к PLL обрабатываемой поверхности. После загрузки, места устройства, содержащие клетки обратно в инкубаторе в течение 10 минут, чтобы дать клеткам прикрепить. Через 10 минут заполнить резервуары со средствами массовой информации и разместить устройств еще в инкубаторе.