Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

1. Preparação da solução capilar e DNA para injecção Purificar DNA plasmídeo com um Maxi-prep ou método equivalente, e fazer uma concentração final de 2-3 mcg / mL. Alíquota de 100 mg de DNA, adicionar 10μl do corante verde rápido (1% de ações) e TE (10 mM Tris Base, 1mM EDTA Solution, pH 8.0) e ajustar o volume para 100 ml para fazer a concentração final para DNA mix de injeção para 1μg / mL. A concentração de DNA plasmidial podem ser alteradas depende do tamanho do plasmídeo, e também a sua eficiência de transfecção, que precisa ser testado individualmente. Girar a solução de DNA por 5 minutos a 14.000 RPM à temperatura ambiente e recolher o sobrenadante para remover qualquer resíduo. Puxar um capilar de vidro tubos de vidro tubea capilar utilizando um extrator de micropipeta. Belisque a ponta com uma pinça para fazer a ponta tem um diâmetro M 20-30. Medida 800 M-1 mm da ponta e verifique o diâmetro externo é menor que 60 mm (Fig. 1A). Conectar o capilar ao micromanipulador, e encha com óleo mineral. Para preencher o capilar com a solução de DNA, mergulhe a ponta na solução e sugar até a solução de DNA. 2. Vara eletrodos de platina Aqui usamos eletrodos revestidos de platina (Nepe gene, CUY611P2-1) para electroporate em região superficial do cérebro, como o córtex (Fig. 1F). 3. Preparação de micro-eletrodos Use micro-eletrodos para electroporated em partes profundas do cérebro (ie, o tálamo eo hipotálamo) (Fig. 2B-E). Uma extremidade do tungstênio (para eletrodos negativos) e platina (para eletrodos positivos) é enrolado em fios dourados e os pinos fixados com parafilme. Insira o fio à haste de um cotonete e embrulhar ambas as extremidades com parafilme (Figura 1B). Uniformemente aguçar a ponta do fio com lixa até atingir 20-30 mM diâmetro externo e 60 mm de 800 M-1 mm da ponta (Fig. 1C e D). Aplique uma camada fina de unha polonês para o fio para o isolamento. Após a unha polonês secar, use um cotonete embebido em acetona para removê-lo da ponta (cerca de 200 mM da ponta). Importante: A fim de evitar danos ao útero do rato, a parte dentro de 800 M-1 mm da ponta não deve ter mais de 70 m de diâmetro (Fig. 1E). 4. Preparação da cirurgia Anestesiar um rato grávidas (E9.5-E15.5). Demonstramos anestesiados com pentobarbital sódico grau farmacêutico (Tabela II, 50 mg por grama de peso corporal, injetar intraperitonealmente e aguarde 5 min). Alternativas para pentobarbital sódico como um anestésico Ketamina incluem injeção / Xilazina ou anestésicos de gás (gás é preferível para os procedimentos de curta duração). A injecção deve ser feito com atenção para evitar quaisquer órgãos, caso contrário ele irá causar danos para o útero ou matar animais. Quando IP sucesso é feito, a taxa de sobrevivência é mais do que 95%. Também a cirurgia pode ser realizada ao ar livre no meio ambiente. Antes de iniciada a operação, teste para a falta de resposta do animal a beliscar seus pés para confirmar anestésico. Raspar o cabelo do abdômen com uma lâmina de barbear e EtOH 50%. Prepare a pele com a alternância de scrubs de betadine e álcool (70%). Faça uma incisão na linha média abdominal com uma tesoura fina e retire todos os cornos uterinos com cuidado sobre a 37 ° C pré-aquecido tampão fosfato (PBS)-umedecidos gaze de algodão, que é colocado em torno da ferida. Manter a umidade do útero com PBS de todos os tempos. Segure um cabo de fibra óptica flexível entre os dedos indicador e médio e colocá-lo sob o corno uterino. Cabo limpo com EtOH 70% antes do uso. Sem microscópio ou lupa é necessário para visualização. Útero posição entre o cabo de fibra óptica a luz óptica eo polegar, e aperte suavemente para empurrar para cima o embrião mais perto da parede uterina. 5. Injeção de DNA e eletroporação Quando embrião é posicionado, insira capilar de vidro cuidadosamente em ventrículo-alvo e injetar cerca de 1 mL de solução de DNA (Fig. 2A). Eletroporação para a parte superficial da brainIf usando com eletrodos revestidos de platina para electoporation, coloque os eletrodos fora do útero e aplicar sugerido de onda quadrada pulsos de corrente de acordo com a instrução de fabricação (Tabela I). Se usingFor eletroporação a parte mais profunda do cérebro, eletroporação nmicro, eletrodos tipo eedle são usados. Iinsert um eletrodo de tungstênio fino negativo em DNA injetado ventrículo e um eletrodo de platina para o útero e região-alvo lugar entre dois eletrodos, em seguida, aplicar sugerido de onda quadrada pulsos de corrente (Tabela I) (Fig. 2B). 6. Eletroporação pós Coloque o corno uterino de volta em sua origlocalização inal com e adicionar 500 mL de 37 ° C pré-aquecido PBS. Sutura a camada interna com sutura cirúrgica e camada externa estreita com um clipe autoclipauto 9 mm. Animais colocar em uma almofada de aquecimento por 2 horas para permitir a recuperação da anestesia. Analgésicos como o carprofeno ou buprenorfina pode ser administrada para a dor pós-operatória. 7. Resultados representativos: Alguns exemplos de eletroporação cortical de pCAG-EYFP construir usando eletrodos de platina vara em momentos diferentes são mostradas na figura Figura 32. Cérebros são electroporated na E13.5, E14.5 e E15.5, e colhida no dia pós-natal (P) 6. ÅO coloração ntibody de RORc revela a posição da camada 4 e posição das células transfectadas EYFP são revelados por GFP coloração de anticorpos, e ambas as imagens são super impostas (Fig. 3A e B). Rotulados células corticais são camada de células corticais electroporated é claramente diferente em cada experimento (Fig. 32), o que sugere dependente do tempo eletroporação faz cortical camada específica GOF / LOF possível. A viabilidade de embriões e eficiência de transfecção de células varia dependendo da idade do embrião e do local de eletroporação. Amostras estão apresentadas na Tabela 1, no entanto, as condições devem ser otimizados para cada eletroporação dependendo do estágio e parte do cérebro. Eletroporação em tecidos profundos, tais como tálamo eo hipotálamo com o uso de eletrodos de platina pau muitas vezes dar baixa eficiência (Tabela 1). Este problema pode ser resolvido usando micro-eletrodos whichelectrodes, que chegará às partes profundas do cérebro. Figura 3 4 exemplo mostra de pCAG-EYFP eletroporação no diencéfalo desenvolvimento. Solução de DNA plasmídeo é injetado no 3 º ventrículo na E11.5 e seguido por micro eletroporação (Fig. 3C4C). A área é restrita electroporated no tálamo, onde a maioria do projeto axônios para o córtex (Fig. 3B4B). Axon projeção para camada 4 do córtex também pode ser visualizado por EYFP, que fillesfills o neurônio inteiro. (Fig. 3A4A). Figura 1. Esquemática dos desenhos animados demonstrando a forma correta do capilar. (A) Um tubo capilar de vidro é puxado através de um puxador de micropipeta para fazer certa forma. Uma dica é off prensado por uma pinça para torná-lo 20-30 mM. Medida 800 M-1 milímetro da ponta (faixa vermelha) e certifique-se que o diâmetro externo é menos de 60 mm (faixa verde). (B) end Um dos fios de tungstênio ou platina é enrolada em pinos banhados a ouro e fixado com parafilme. Em seguida, use uma lixa para fazer sua ponta para se tornar 20-30 mM diâmetro externo e 60 mm a partir de 1 mm da ponta. (C) Imagem do fio de tungstênio antes shaping. (D) Imagem do fio de tungstênio após a modelagem. (E) Imagem do fio de tungstênio após a aplicação de fina camada de unha polonês. Barra de escala em E é de 10 mM (menor escala) para CE. (F) Stick eletrodos de platina (Nepa gene. CUY611P2-1). Barra de escala em F é de 2 mm. Figura esquema dos desenhos animados 2. Procedimento cirúrgico. (A) Diagrama de injecção ventrículo lateral ou embriões de grandes dimensões (lado esquerdo) e em 3 º ventrículo ou embriões pequenos (lado direito). (B) Diagrama de electrporation pelo eletrodo de platina stick (lado esquerdo) e com agulha de eletrodo tipo (lado direito). Figura 3. Desenvolvimento do mouse telencéfalo foi electroporated com pCAG-EYFP no E13.5 (A), E14.5 (B) e E15.5 (C) e colhidas em P6. Cérebros foram seccionados coronal e corados com GFP anticorpo ou anticorpos RORc separadamente e imagens são mesclados. (A) de Eletroporação pCAG-EYFP plasmídeo em E13.5 transfectar muitos camada 4 neurônios. que se sobrepõem a camada de 4 marcadores RORc. (B) de Eletroporação pCAG-EYFP plasmídeo de células E14.5 transfecção, que são mais superficiais do que os neurônios da camada 4. (C) E15.5 eletroporação rótulo muitos neurônios superficial, como camada 2 / 3. Barra de escala 200 mM. Figura 4. Transfection da EYFP em tálamo-cortical axônios (TCA). (A) terminus TCA na camada cortical 4 é revelado por GFP coloração de anticorpos. RORc coloração do anticorpo é usado para revelar uma posição de camada 4. Ambas as imagens são tiradas de mesma seção e se fundiram. (B) Posição da eletroporação para o tálamo também é indicado pelo GFP coloração de anticorpos e coloração RORc, que a expressão é restrita no tálamo 11. (C) esquema dos desenhos animados para a eletroporação talâmica e projeção TCA são mostrados. Barra de escala 200 mM.