Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon
Summary
Gelişmekte olan fare beyninin içine bir gen transferi yöntemi eşsiz bir cerrahi yöntem ve elektrotlar özel şekli ile tarif edilir. Bu benzersiz tekniği, beyin gelişimi okuyan birçok Nörobilimadamları yardımcı olacak zamansal ve mekansal plazmid DNA transfeksiyon sağlar.
Abstract
Gelişmekte olan beyin, sinyal molekülleri ve akson rehberlik molekülleri, yerel gen transferi veya knock-out gereklidir dahil olmak üzere belirli bir bölgedeki genlerin işlevini anlamak için. Knock-knock-out hedefleme Gen yerel bölgeye belirli bir zahmetli, masraflı CRE hattı, ve zaman alıcı bir kombinasyonu ile gerçekleştirmek mümkün. Bu nedenle, basit bir transfeksiyon yöntemi, kısa sürede yapılabilir bir utero elektroporasyon tekniği, transgenik hayvanlar 1,2 nesil öncesinde aday genlerin olası fonksiyon testi için kullanışlı olacaktır. Buna ek olarak, in utero elektroporasyon, belirli bir CRE hattı var olan beyin alanları hedef ve embriyonik öldürücülüğü 3,4 sınırlayacaktır . Burada, biz, basit ve kullanışlı bir gen transferi için iki farklı tür elektrotlar birleştirerek gelişmekte olan beyin hedef alanlara utero elektroporasyon bir yöntem mevcut. İlk olarak, benzersiz bir optik fiber optik ışık kablosu kullanarak bir embriyo tutma yöntemi ventriküller ve hedeflenen beyin alanı 5,6 iğne tipi elektrodlar ekleme içine hedeflenen DNA çözüm enjeksiyon için görünür küçük embriyolar (E9.5) yapacaktır . Bu nedenle, kortikal alanı gibi beyin desenlendirme E9.5 bu erken elektroporasyon tüm alanı desenlendirme olayı anlamak için büyük bir katkı yapmak, erken embriyonik aşamada meydana gelir. İkincisi, bir kılcal kesin şeklini kılcal ekleme delik yaparak rahim zarar görmesini engeller. Ayrıca, iğne elektrotlar kesin şeklini tungsten ve platin tel ile oluşturulan ve zımpara kağıdı kullanarak bilenmiş ve tırnak cilası 7, bu protokol çok detaylı olarak açıklanan bir yöntem ile izole edilir. Bu benzersiz tekniği, beynin sınırlı alanlar içine plazmid DNA transfeksiyon sağlar ve küçük embriyolar electroporated olmasını sağlayacak. Bu, çok erken embriyonik aşamada hücre farklılaşması, hücre göçü, akson rehberliği üzerinde çalışıyoruz birçok bilim adamları için yeni bir pencere açmak için yardımcı olacaktır. Ayrıca, bu teknik, bilim adamları, birçok bölgeye özel CRE hatları fonksiyon kazanç (GOF) veya fonksiyon (LOF) analizleri kaybı var talamus ve hipotalamus, beyin gibi gelişmekte olan derin bölüme plazmid DNA transfect sağlayacaktır.
Protocol
Discussion
Bu protokol, biz sadece, farklı şeklinde elektrotlar kullanarak küçük bir embriyonik beyin kısıtlı alana pCAG EYFP transfeksiyon tekniği yararları nitelendirdi. Transfeksiyon verimlilik karşılaştırması farklı organizatörü tarafından daha önce açıklandığı için, hücre tipi özgüllüğü 1 gösterir. Ancak, sadece geçici ve plazmid bağlıdır değişir transfeksiyon gibi tekniği, sınırlamalar vardır, herhangi bir hücreyi özgüllüğü sahip değildir ve transfekte hücrelerinin sayısını kontrol altında tutmak zordur. ThereforeHowever, bu protokolü diğer tekniklerle birleştirerek daha farklı işleme yöntemleri için olanakları sağlayacaktır. İlk olarak, plazmid DNA hücre içine özel organizatörü birleştiren, nöronlar, glial hücreler ve astrositler hücre türüne özgü transfeksiyon sağlayacaktır. İkincisi, transfeksiyon geçici olduğundan, sonraki hayatında genin fonksiyonunu analiz etmek isteyen bilim adamları için uygun değildir. Bu nedenle, plazmid DNA genom entegre olmak için bir transposase ile birlikte istikrarlı bir transfeksiyon 8 dönüştürmek . Tet-veya tet-off sistemi, evlat edinme 8 sinir hücreleri veya hücre tipine özgü gen ekspresyonu zamanlama işlemek için mümkün kılacaktır. Alternatif olarak, bu protokol tamoksifen-indüklenebilir Cre-ER (T) recombinases 9 ve muhabir fareler 10 birleştirebilirsiniz.
Dokuların Bu geniş erişilebilirlik nörobilim kullanılan deneysel tasarımları büyük ölçüde değişecektir.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma RIKEN Beyin Bilimi Enstitüsü (BSI), İnsan Frontier Bilim Programı (HFSP) (TS verilen) ve RIKEN Junior Araştırma İşbirliği Programı (JRA), MK verilen RIKEN Beyin Bilimi Enstitüsü (BSI), İnsan Frontier Lisans Programı tarafından finanse edildi (HFSP) (TS ödüllendirildi) ve RIKEN Seyirci Araştırma İşbirliği Programı (JRA, MK verilen) bu işi finanse.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| bare tungsten wire diameter 125 μm | A-M systems | 797600 |
| bare platinum wire diameter 125 μm | A-M systems | 767000 |
| Stick electrodes | Nepa gene | CUY610P4-1 |
| glass capillary tube | Stoelting | 50611 |
| micromanipulator | KD Scientific | KDS310 |
| scissors | ROBOZ | RS-5865 |
| pulse generator | A-M Systems | Model 2100 |
| 9 mm autoclip | ROBOZ | RS-9260 |
| gold-plated pins | WPI | 5482 |
| RORc antibody | Perseus Proteomics | H3925 |
Referências
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociência. 103, 865-872 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologia do Desenvolvimento. 240, 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Imayoshi, I., Shimogori, T., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Hes genes and neurogenin regulate non-neural versus neural fate specification in the dorsal telencephalic midline. Development. 135, 2531-2541 (2008).
- Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Avian Embryology. Methods in Cell Biology. Vol 87, 271-271 (2008).
- Feil, R. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 10887-10890 (1996).
- Indra, A. K. Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ERT and Cre-ERT2 recombinases. Nucleic Acids Research. 27, 4324-4327 (1999).
- Nakagawa, Y., O’Leary, D. D. M. Dynamic patterned expression of orphan nuclear receptor genes ROR alpha and ROR beta in developing mouse forebrain. Developmental Neuroscience. 25, 234-244 (2003).
