עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג'ין מבוקרת transfection Spatiotemporal
Summary
העברת גן שיטה למוח עכבר בפיתוח מתואר באמצעות שיטה ניתוחית ייחודית צורה מיוחדת של אלקטרודות. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד temporally מרחבית, אשר יסייעו מדעני מוח רבים בחקר התפתחות המוח.
Abstract
על מנת להבין את תפקידם של גנים הביע באזור מסוים של המוח המתפתח, כולל מולקולות איתות והדרכה מולקולות האקסון, העברת גנים מקומיים או עקום החוצה נדרשת. ג'ין מיקוד עקום או עקום החוצה לאזורים המקומי ניתן לבצע בשילוב עם קו Cre ספציפי, שהוא מייגע, יקר, זמן רב. לכן, שיטה transfection פשוט, טכניקה electroporation ברחם, אשר יכול להתבצע עם זמן קצר, יהיה בהישג יד כדי לבדוק את תפקוד אפשרי של גנים מועמדים לפני דור 1,2 חיות טרנסגניות. בנוסף לכך, ב electroporation ברחם מטרות אזורים במוח שבהם אין קו ספציפי Cre קיים, יגביל הקטלניות עובריים 3,4. כאן, אנו מציגים שיטה ב electroporation ברחם שילוב של שני סוגים שונים של אלקטרודות להעברת גנים קל ונוח לתחומי היעד של המוח המתפתח. ראשית, שיטת החזקה ייחודית של עוברים באמצעות סיב אופטי כבל אופטי אור יגרום עוברים קטנים (מ E9.5) גלוי להזרקה פתרון ממוקד דנ"א לתוך החדרים וסוג אלקטרודות מחט הכניסה לאזור המוח ממוקד 5,6. דפוסים של המוח כגון אזור בקליפת המוח מתרחשת בשלב עוברי מוקדם, ולכן, אלה electroporation מוקדם E9.5 תרומה גדולה להבין את האירוע כולו דפוסים אזור. שנית, את הצורה המדויקת של נימי מונע נזק הרחם על ידי יצירת חורים על ידי הכניסה של נימי. יתר על כן, הצורה המדויקת של אלקטרודות מחט נוצרות עם טונגסטן חוט פלטינה חידד שימוש בנייר חול מבודד עם לק 7, שיטה אשר מתואר בפירוט רב בפרוטוקול זה. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד לאזורים מוגבלים של המוח יאפשר עוברי קטן להיות electroporated. זה יעזור, לפתוח חלון חדש של מדענים רבים שעובדים על התמיינות תאים, נדידת תאים, הדרכה האקסון עובריים בשלב מוקדם מאוד. יתרה מכך, טכניקה זו תאפשר למדענים transfect DNA פלסמיד לחלקים העמוקים של המוח המתפתח כגון התלמוס וההיפותלמוס, שם לא רבים ספציפיים באזור קווי Cre קיימים למטרות רווח של הפונקציה (GOF), או הפסד של (LOF) מנתח לתפקד.
Protocol
Discussion
בפרוטוקול זה, אנחנו רק תיאר היתרונות של השיטה של transfection pCAG-EYFP לאזור המוגבל של מוח העובר קטן באמצעות אלקטרודות בצורת שונות. לשם השוואה של יעילות transfection על ידי האמרגן שונה שתואר לעיל, אשר מציגה סוג תא סגוליות 1. עם זאת, ישנן מגבלות על הטכניקה, כגון transfection הוא חולף רק משתנה תלוי פלסמיד, אין לו שום ייחוד תא וקשה לשלוט במספרים של תאים transfected. ThereforeHowever, שילוב של פרוטוקול זה עם טכניקות אחרות יהיה עוד לספק אפשרויות שיטות מניפולציה שונות. ראשית, שילוב מקדם תאים ספציפיים לתוך פלסמיד דנ"א יאפשר לתא מסוג transfection ספציפיים, כגון נוירונים ותאי גלייה ו האסטרוציטים. שנית, מאז transfection הוא חולף, זה לא מתאים מדענים שרוצים לנתח את הפונקציה של הגן בשלב מאוחר יותר בחיים. לכן, בשילוב עם transposase לעשות פלסמיד דנ"א להשתלב בגנום יהיה להמיר אותו לתוך transfection יציב 8. האימוץ הבא של ט או ט את המערכת תאפשר לתפעל את העיתוי או סוג תא ספציפי ביטוי גנים בתאים עצביים 8. לחלופין, אפשר לשלב את זה עם פרוטוקול ועין מתנהלת-טמוקסיפן Cre-ER (T) recombinases 9 ועכברים הכתב 10.
זו נגישות רחבה של רקמות יהיה דרסטי לשנות עיצובים ניסיוניים בשימוש במדעי המוח.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי המכון למדעי המוח RIKEN (BSI), תוכנית האדם Frontier Science (HFSP) (הוענק TS) ו RIKEN תוכנית ג'וניור עמית מחקר (JRA, העניק לח"כ) RIKEN המכון למדעי המוח (BSI), תוכנית אנוש המדע Frontier (HFSP) (הוענק TS) ו RIKEN עמית ג'וניור תוכנית המחקר (JRA, העניק לח"כ) מימנה את העבודה הזאת.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| bare tungsten wire diameter 125 μm | A-M systems | 797600 |
| bare platinum wire diameter 125 μm | A-M systems | 767000 |
| Stick electrodes | Nepa gene | CUY610P4-1 |
| glass capillary tube | Stoelting | 50611 |
| micromanipulator | KD Scientific | KDS310 |
| scissors | ROBOZ | RS-5865 |
| pulse generator | A-M Systems | Model 2100 |
| 9 mm autoclip | ROBOZ | RS-9260 |
| gold-plated pins | WPI | 5482 |
| RORc antibody | Perseus Proteomics | H3925 |
Referências
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociência. 103, 865-872 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologia do Desenvolvimento. 240, 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Imayoshi, I., Shimogori, T., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Hes genes and neurogenin regulate non-neural versus neural fate specification in the dorsal telencephalic midline. Development. 135, 2531-2541 (2008).
- Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Avian Embryology. Methods in Cell Biology. Vol 87, 271-271 (2008).
- Feil, R. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 10887-10890 (1996).
- Indra, A. K. Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ERT and Cre-ERT2 recombinases. Nucleic Acids Research. 27, 4324-4327 (1999).
- Nakagawa, Y., O’Leary, D. D. M. Dynamic patterned expression of orphan nuclear receptor genes ROR alpha and ROR beta in developing mouse forebrain. Developmental Neuroscience. 25, 234-244 (2003).
