فأر في الرحم Electroporation : الشواهد ترنسفكأيشن جين Spatiotemporal
Summary
يوصف أسلوب نقل الجينات في مخ الفأر النامية باستخدام أسلوب فريد الجراحية وشكل خاص من الأقطاب الكهربائية. هذا الأسلوب الفريد يسمح ترنسفكأيشن من الحمض النووي البلازميد الزمان والمكان ، والتي ستساعد الكثير من علماء الأعصاب في دراسة تطور الدماغ.
Abstract
من أجل فهم وظيفة الجينات التي أعرب عنها في منطقة محددة من الدماغ النامي ، بما في ذلك الجزيئات والجزيئات إشارات التوجيه محوار المحلية ونقل الجينات أو تدق خارج المطلوبة. استهداف الجينات في ضرب أو ضرب ، في المناطق المحلية من الممكن أن تؤدي مع تركيبة لجنة المساواة العرقية مع خط معينة ، وهو أمر شاق ومكلف ، وتستغرق وقتا طويلا. ولذلك ، فإن الأسلوب ترنسفكأيشن بسيط ، وهو في الرحم electroporation التقنية ، التي يمكن القيام بها مع وقت قصير ، قد تكون مفيدة لاختبار وظيفة ممكن من الجينات المرشحة السابقة لجيل من الحيوانات المعدلة وراثيا 1،2. بالإضافة إلى ذلك ، في electroporation الرحم يستهدف المناطق من الدماغ حيث يوجد خط محدد لجنة المساواة العرقية موجودة ، وسوف تحد من الفتك الجنينية 3،4. هنا ، فإننا نقدم وسيلة لelectroporation الرحم في الجمع بين نوعين مختلفين من الأقطاب الكهربائية لنقل الجينات بسيطة ومريحة في المناطق المستهدفة من الدماغ النامية. أولا ، سوف أسلوب عقد فريد من أجنة باستخدام الألياف البصرية كابل الألياف الخفيفة جعل أجنة صغيرة (من E9.5) مرئية لاستهداف الحمض النووي حقن المحلول إلى البطينين وإبرة أقطاب اكتب الى المنطقة المستهدفة 5،6 الدماغ. والزخرفة في الدماغ مثل منطقة القشرية يحدث في مرحلة جنينية مبكرة ، وبالتالي ، فإن هذه electroporation E9.5 المبكر من تقديم مساهمة كبيرة لفهم الحدث الزخرفة كامل المنطقة. الثانية ، والشكل الدقيق ليمنع الضرر الشعرية الرحم عن طريق الثقوب التي الإدراج من الشعيرات الدموية. وعلاوة على ذلك ، يتم إنشاء الشكل الدقيق للأقطاب الإبرة مع التنغستن والبلاتين وشحذ الأسلاك باستخدام الرمل ورقة ومعزولة مع طلاء الأظافر 7 ، وهو الأسلوب الذي يوصف بقدر كبير من التفصيل في هذا البروتوكول. هذا الأسلوب الفريد يسمح ترنسفكأيشن من الحمض النووي البلازميد في المناطق المحظورة من الدماغ ، وسوف يتسنى electroporated أجنة صغيرة. هذا سوف يساعد على فتح نافذة جديدة لكثير من العلماء الذين يعملون على تمايز الخلايا ، والهجرة الخلية ، والتوجيه محوار في المرحلة الجنينية المبكرة جدا. وعلاوة على ذلك ، فإن هذه التقنية تسمح للعلماء transfect DNA البلازميد إلى أجزاء من الدماغ العميق النامية مثل المهاد وتحت المهاد ، حيث لا يوجد الكثير من خصائص المنطقة وجود خطوط لجنة المساواة العرقية لتحقيق مكاسب من وظيفة (صندوق القناص) أو الخسارة من التحليلات (LOF) وظيفة.
Protocol
Discussion
في هذا البروتوكول ، وصفنا فقط فوائد هذه التقنية من ترنسفكأيشن pCAG – EYFP في منطقة محدودة من المخ الجنينية باستخدام أقطاب صغيرة على شكل مختلف. يوصف لمقارنة كفاءة ترنسفكأيشن بواسطة مروج مختلفة من قبل ، مما يدل على خصوصية الخلية من النوع 1. ومع ذلك ، هناك قيود لهذه التقنية ، مثل ترنسفكأيشن هو عابر فقط ويختلف تعتمد على البلازميد ، فإنه لا يملك أي خصوصية الخلية وأنه من الصعب السيطرة على عدد من الخلايا transfected. ThereforeHowever ، فإن الجمع بين هذا البروتوكول مع تقنيات أخرى لتوفير المزيد من فرص التلاعب وسائل مختلفة. أولا ، سوف تشمل المروج خلية معينة في الحمض النووي البلازميد تسمح الخلية من نوع ترنسفكأيشن محددة ، مثل الخلايا العصبية ، الخلايا الدبقية النجمية و. الثانية ، منذ ترنسفكأيشن هو عابر ، قد لا تكون مناسبة للعلماء الذين يريدون تحليل وظيفة الجين في الحياة في وقت لاحق. ولذلك ، فإن تركيبة مع transposase لجعل الحمض النووي البلازميد الاندماج في الجينوم تحويله إلى 8 ترنسفكأيشن مستقرة. وسوف القادم ، وإقرار تيت ، أو نظام تيت حالا تجعل من الممكن التلاعب في توقيت أو خلية نوع محدد التعبير الجيني في الخلايا العصبية 8. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء أن يجمع بين هذا البروتوكول مع محرض – ER – تاموكسيفين لجنة المساواة العرقية (T) recombinases 9 و 10 مراسلا الفئران.
وهذا الوصول واسعة من الأنسجة تغيير جذري تصاميم تجريبية تستخدم في علم الأعصاب.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل معهد العلوم بتبريد الدماغ (BSI) ، برنامج علوم الإنسان الحدودي (HFSP) (منحت لTS) وبرنامج بحوث بتبريد عضو مشارك (الجيش الأحمر الياباني ، التي منحت لMK) بتبريد معهد علوم الدماغ (BSI) ، برنامج علوم الإنسان الحدودي (HFSP) ممولة (منحت لTS) وبتبريد باحث مشارك جديد برنامج (الجيش الأحمر الياباني ، التي منحت لعضو الكنيست) هذا العمل.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| bare tungsten wire diameter 125 μm | A-M systems | 797600 |
| bare platinum wire diameter 125 μm | A-M systems | 767000 |
| Stick electrodes | Nepa gene | CUY610P4-1 |
| glass capillary tube | Stoelting | 50611 |
| micromanipulator | KD Scientific | KDS310 |
| scissors | ROBOZ | RS-5865 |
| pulse generator | A-M Systems | Model 2100 |
| 9 mm autoclip | ROBOZ | RS-9260 |
| gold-plated pins | WPI | 5482 |
| RORc antibody | Perseus Proteomics | H3925 |
Referências
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociência. 103, 865-872 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Biologia do Desenvolvimento. 240, 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Imayoshi, I., Shimogori, T., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Hes genes and neurogenin regulate non-neural versus neural fate specification in the dorsal telencephalic midline. Development. 135, 2531-2541 (2008).
- Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Avian Embryology. Methods in Cell Biology. Vol 87, 271-271 (2008).
- Feil, R. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 10887-10890 (1996).
- Indra, A. K. Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ERT and Cre-ERT2 recombinases. Nucleic Acids Research. 27, 4324-4327 (1999).
- Nakagawa, Y., O’Leary, D. D. M. Dynamic patterned expression of orphan nuclear receptor genes ROR alpha and ROR beta in developing mouse forebrain. Developmental Neuroscience. 25, 234-244 (2003).
