Amplificación y cuantificación del ARN VIH-1 en individuos infectados por VIH con cargas virales por debajo del límite de detección por parte de Standard Ensayos Clínicos
Summary
Cuantificación de los niveles de ARN VIH-1 en plasma y la secuencia única de VIH-1 genomas de las personas con cargas virales por debajo del límite de detección (50-75 copias / ml) es difícil. Aquí se describe cómo extraer y cuantificar el ARN viral en plasma utilizando un ensayo de PCR en tiempo real que mide de manera fiable ARN VIH-1 a partir de 0,3 copias / ml y la forma de amplificar el genoma viral mediante secuenciación del genoma individual, a partir de muestras con cargas virales muy bajas.
Abstract
Amplificación de los genes virales y la cuantificación de VIH-1 ARN del VIH-1 las personas infectadas con cargas virales por debajo del límite de detección de los ensayos estándar (por debajo de 50-75 copias / ml) es necesario para comprender mejor la dinámica viral y la interacción virus de acogida en los pacientes que naturalmente, el control de la infección y los que están en tratamiento antirretroviral combinado (TARC).
A continuación se describe la forma de amplificar el genoma viral por la secuenciación del genoma único (el protocolo de SGS) 13, 19 y la forma de cuantificar con precisión ARN VIH-1 en pacientes con baja carga viral (la copia de un solo ensayo (SCA) de protocolo) 12, 20.
El ensayo de una sola copia es un ensayo de PCR en tiempo real con la sensibilidad en función del volumen de plasma que se analizaron. Si un solo genoma del virus se detecta en 7 ml de plasma, entonces el número de copias de ARN se informó de que 0,3 copias / ml. El ensayo tiene una prueba de control interno para la eficiencia de la extracción de RNA, y los controles para la amplificación de ADN o posible contaminación. Muestras de los pacientes se midieron por triplicado.
La secuenciación del genoma de un solo ensayo (SGS), muy utilizado y se considera que no mano de obra 3, 7, 12, 14, 15, es un ensayo de dilución límite, en qué extremo diluida cDNA producto se distribuye en un 96-así plato. De acuerdo con una distribución de Poisson, cuando menos de 1 / 3 de los pozos de dar un producto, hay una probabilidad del 80% de la resultante del producto de PCR de la amplificación es de una sola molécula de ADNc. SGS tiene la ventaja sobre la clonación de no ser sometida a muestreo y de no ser sesgado por PCR a introducir recombinación 19. Sin embargo, el éxito de la amplificación del SCA y SGS dependen de diseño de la cartilla. Ambos ensayos fueron desarrollados para el VIH-1 subtipo B, pero puede ser adaptado para otros subtipos y en otras regiones del genoma de los cebadores cambio, las sondas, y las normas.
Protocol
Discussion
VIH-1 en individuos infectados en el tratamiento antirretroviral combinado (TARC) o que, naturalmente, el control de la infección tienen cargas virales muy bajas, por lo general alrededor de 1 copia por mililitro de plasma 4, 11, 12, 17, 18. La carga viral en pacientes con un control natural, a menudo fluctúan alrededor de un conjunto individual de 1, 2, 17. La sensibilidad de los ensayos descritos en este documento depende en gran medida el volumen de entrada de plasma. En general, hemos estado …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a los pacientes que participaron en los numerosos estudios de VIH-1.
JMC fue profesor de Investigación de la Sociedad Americana del Cáncer con el apoyo de la Fundación FM Kirby.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Random hexamers (500 ug/ml) | Promega | C118A | |
| Taqman buffer A | Applied Biosystems | 4304441 | |
| RNAsin (40 U/ul) | Promega | N211B | |
| RT enzyme (200 U/ul) | Strategene | 600107-51 | |
| Amplitaq Gold DNA polymerase | Applied Biosystems | 4311814 | 6-pack |
| Amplitaq 10XGold PCR buffer II | Applied Biosystems | 4311814 | comes with the enzyme |
| Magnesiumcloride 25 mM | Applied Biosystems | 4311814 | comes with the enzyme |
| 1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM | Invitrogen | AM9855G | |
| Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul | Invitrogen | 18080-044 | |
| Superscript III 10X buffer | Invitrogen | comes with the enzyme | |
| DTT 100 mM | Invitrogen | comes with the enzyme | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul | Invitrogen | 11304-102 | |
| 10X High Fidelity PCR Buffer | Invitrogen | 11304-102 | comes with the enzyme |
| Proteinase-K 20 mg/ml | Ambion | 2546 | |
| Guanidinium Thiocyanate solution 6M | FlukaBiochemica | 50983 | |
| Glycogen 20 mg/ml | Roche | 10901393001 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 19516 | |
| Ethanol 70% | Sigma-Aldrich | E702-3 | |
| Molecular grade water | Gibco/Invitrogen | 10977-015 | |
| dNTPs (25 mmol each) | Bioline | BIO-39025 |
| Name of Euipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm) | Seaton Scientific | 6041 | |
| White Delrin crowns | Seaton Scientific | 4020 | Caps for the Easy Seal Tubes |
| Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml | Beckman | 361642 | |
| Hex driver ½ inc opening | Seaton Scientific | 4013 | |
| cap removal tupe | Seaton Scientific | 4014 | |
| 5 ml serological pipettes | Costar | 4051 | |
| Pipetboy | any | ||
| 15 ml Transfer pipettes | ISC Bioexpress | P-5005-7 | |
| 5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip | VWR | 14670-329 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | ||
| 1 ml centrifuge tubes | any | ||
| Tris buffer Saline tablets | Sigma-Aldrich | T5030-100TAB | |
| Ultracentrifuge and rotor | Sorval | 90SE and T-1270 | |
| 96-well PCR plates | Biorad | HSS-9601 | |
| 50 ml Reagent reservoir | Costar | 4870 | |
| Microamp optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems | N801-0560 | |
| Optical plate covers | Applied Biosystems | 4333183 | |
| MicroAmp Optical Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | |
| Microseal A film | Biorad | MSA-5001 | |
| 2 ml centrifuge tubes | Any | ||
| 1% agarose gels (E-gel, invitrogen) | Invitrogen | G-7008-01 | |
| E-base (Invitrogen) | Invitrogen | EB-M03 |
EDTA Collection tubes any brand
Referências
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