Amplificar e Quantificação do HIV-1 RNA no indivíduos infectados pelo HIV com carga viral abaixo do limite de detecção pela Standard Ensaios Clínicos
Summary
Quantificar os níveis de HIV-1 RNA no plasma e seqüenciamento única HIV-1 genomas de indivíduos com carga viral abaixo do limite de detecção (50-75 cópias / ml) é difícil. Aqui nós descrevemos como extrair e quantificar RNA viral no plasma usando um ensaio de PCR em tempo real, que de forma confiável medidas HIV-1 RNA até 0,3 cópias / ml e como amplificar genomas virais por seqüenciamento do genoma único, a partir de amostras com cargas virais muito baixas.
Abstract
Amplificar genes virais e quantificar HIV-1 RNA do HIV-1 indivíduos infectados com cargas virais abaixo do limite de detecção por ensaios padrão (abaixo de 50-75 cópias / ml) é necessário ter uma visão para a dinâmica viral e interações hospedeiro do vírus em pacientes que naturalmente controlar a infecção e aqueles que estão em terapia anti-retroviral combinada (TARC).
Aqui nós descrevemos como para amplificar genomas virais por uma única seqüenciamento do genoma (o protocolo SGS) 13, 19 e como quantificar com precisão HIV-1 RNA em pacientes com baixa carga viral (a cópia de um único ensaio (SCA) protocolo) 12, 20.
O ensaio de um único exemplar é um real-time PCR com sensibilidade, dependendo do volume de plasma sendo ensaiadas. Se um genoma único vírus é detectado em 7 ml de plasma, então o número de cópias de RNA é de 0,3 cópias / ml. O ensaio tem um teste de controlo interno para a eficiência de extração de RNA, e controles para a amplificação de DNA ou possível contaminação. Amostras de pacientes são medidos em triplicata.
O seqüenciamento do genoma de um único ensaio (SGS), hoje amplamente utilizado e considerado como não-trabalho intensivo 3, 7, 12, 14, 15, é um ensaio por diluição limitante, em qual ponto de extremidade produto diluído cDNA é espalhada sobre uma de 96 poços prato. De acordo com uma distribuição de Poisson, quando menos de 1 / 3 dos poços dão produto, há uma chance de 80% resultante do produto de PCR de amplificação sendo a partir de uma única molécula de cDNA. SGS tem a vantagem sobre a clonagem de não ser submetido a reamostragem e não ser influenciada por PCR-introduzido recombinação 19. No entanto, o sucesso de amplificação da SCA e SGS dependem desenho de primers. Ambos os ensaios foram desenvolvidos para HIV-1 subtipo B, mas pode ser adaptado para outros subtipos e em outras regiões do genoma de primers mudando, sondas, e padrões.
Protocol
Discussion
HIV-1 indivíduos infectados em tratamento antiretroviral combinada (TARC) ou que naturalmente controlar a infecção têm cargas virais muito baixas, normalmente cerca de 1 cópia por ml de plasma 4, 11, 12, 17, 18. Carga viral em pacientes com controle natural, muitas vezes oscilam em torno de um conjunto individual ponto 1, 2, 17. A sensibilidade dos ensaios aqui descritos é altamente dependente do volume de entrada de plasma. Geralmente, temos vindo a trabalhar com 7 ml de plasma, mas os resul…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de reconhecer os pacientes que participaram nos estudos de muitos de HIV-1.
JMC era um professor da pesquisa da Sociedade Americana de Câncer com o apoio da FM Kirby Foundation.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Random hexamers (500 ug/ml) | Promega | C118A | |
| Taqman buffer A | Applied Biosystems | 4304441 | |
| RNAsin (40 U/ul) | Promega | N211B | |
| RT enzyme (200 U/ul) | Strategene | 600107-51 | |
| Amplitaq Gold DNA polymerase | Applied Biosystems | 4311814 | 6-pack |
| Amplitaq 10XGold PCR buffer II | Applied Biosystems | 4311814 | comes with the enzyme |
| Magnesiumcloride 25 mM | Applied Biosystems | 4311814 | comes with the enzyme |
| 1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM | Invitrogen | AM9855G | |
| Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul | Invitrogen | 18080-044 | |
| Superscript III 10X buffer | Invitrogen | comes with the enzyme | |
| DTT 100 mM | Invitrogen | comes with the enzyme | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul | Invitrogen | 11304-102 | |
| 10X High Fidelity PCR Buffer | Invitrogen | 11304-102 | comes with the enzyme |
| Proteinase-K 20 mg/ml | Ambion | 2546 | |
| Guanidinium Thiocyanate solution 6M | FlukaBiochemica | 50983 | |
| Glycogen 20 mg/ml | Roche | 10901393001 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 19516 | |
| Ethanol 70% | Sigma-Aldrich | E702-3 | |
| Molecular grade water | Gibco/Invitrogen | 10977-015 | |
| dNTPs (25 mmol each) | Bioline | BIO-39025 |
| Name of Euipment | Company | Catalogue number | Comments |
| Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm) | Seaton Scientific | 6041 | |
| White Delrin crowns | Seaton Scientific | 4020 | Caps for the Easy Seal Tubes |
| Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml | Beckman | 361642 | |
| Hex driver ½ inc opening | Seaton Scientific | 4013 | |
| cap removal tupe | Seaton Scientific | 4014 | |
| 5 ml serological pipettes | Costar | 4051 | |
| Pipetboy | any | ||
| 15 ml Transfer pipettes | ISC Bioexpress | P-5005-7 | |
| 5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip | VWR | 14670-329 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | ||
| 1 ml centrifuge tubes | any | ||
| Tris buffer Saline tablets | Sigma-Aldrich | T5030-100TAB | |
| Ultracentrifuge and rotor | Sorval | 90SE and T-1270 | |
| 96-well PCR plates | Biorad | HSS-9601 | |
| 50 ml Reagent reservoir | Costar | 4870 | |
| Microamp optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems | N801-0560 | |
| Optical plate covers | Applied Biosystems | 4333183 | |
| MicroAmp Optical Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | |
| Microseal A film | Biorad | MSA-5001 | |
| 2 ml centrifuge tubes | Any | ||
| 1% agarose gels (E-gel, invitrogen) | Invitrogen | G-7008-01 | |
| E-base (Invitrogen) | Invitrogen | EB-M03 |
EDTA Collection tubes any brand
Referências
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