मॉडलिंग प्रासंगिक और क्रोनिक माइग्रेन के तंत्रिका इम्यून संकेतन फैल अवसाद का प्रयोग इन विट्रो में</em
Summary
माइग्रेन और उसके परिवर्तन क्रोनिक माइग्रेन उपचार के विकल्प में सुधार की जरूरत में अपार स्वास्थ्य बोझ हैं. हम को परिभाषित कैसे तंत्रिका प्रतिरक्षा संकेतन माइग्रेन संवेदनशीलता modulates की तलाश है, मॉडलिंग<em> इन विट्रो में</em> Hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों में उपन्यास चिकित्सात्मक लक्ष्य को विकसित करने के साधन के रूप में फैल अवसाद, का उपयोग कर.
Abstract
Migraine and its transformation to chronic migraine are healthcare burdens in need of improved treatment options. We seek to define how neural immune signaling modulates the susceptibility to migraine, modeled in vitro using spreading depression (SD), as a means to develop novel therapeutic targets for episodic and chronic migraine. SD is the likely cause of migraine aura and migraine pain. It is a paroxysmal loss of neuronal function triggered by initially increased neuronal activity, which slowly propagates within susceptible brain regions. Normal brain function is exquisitely sensitive to, and relies on, coincident low-level immune signaling. Thus, neural immune signaling likely affects electrical activity of SD, and therefore migraine. Pain perception studies of SD in whole animals are fraught with difficulties, but whole animals are well suited to examine systems biology aspects of migraine since SD activates trigeminal nociceptive pathways. However, whole animal studies alone cannot be used to decipher the cellular and neural circuit mechanisms of SD. Instead, in vitro preparations where environmental conditions can be controlled are necessary. Here, it is important to recognize limitations of acute slices and distinct advantages of hippocampal slice cultures. Acute brain slices cannot reveal subtle changes in immune signaling since preparing the slices alone triggers: pro-inflammatory changes that last days, epileptiform behavior due to high levels of oxygen tension needed to vitalize the slices, and irreversible cell injury at anoxic slice centers.
In contrast, we examine immune signaling in mature hippocampal slice cultures since the cultures closely parallel their in vivo counterpart with mature trisynaptic function; show quiescent astrocytes, microglia, and cytokine levels; and SD is easily induced in an unanesthetized preparation. Furthermore, the slices are long-lived and SD can be induced on consecutive days without injury, making this preparation the sole means to-date capable of modeling the neuroimmune consequences of chronic SD, and thus perhaps chronic migraine. We use electrophysiological techniques and non-invasive imaging to measure neuronal cell and circuit functions coincident with SD. Neural immune gene expression variables are measured with qPCR screening, qPCR arrays, and, importantly, use of cDNA preamplification for detection of ultra-low level targets such as interferon-gamma using whole, regional, or specific cell enhanced (via laser dissection microscopy) sampling. Cytokine cascade signaling is further assessed with multiplexed phosphoprotein related targets with gene expression and phosphoprotein changes confirmed via cell-specific immunostaining. Pharmacological and siRNA strategies are used to mimic and modulate SD immune signaling.
Protocol
कई अंक मस्तिष्क स्लाइसें में प्रतिरक्षा संबंधी एसडी संकेत का सफल अध्ययन के लिए बल के लायक हैं. सबसे पहले, उत्तेजनाओं की शुरुआत synchronously ग्रे बात मस्तिष्क की पर्याप्त मात्रा को एसडी आरंभ बिगाड़ना चाहिए. यह एक अंतरफलक है (यानी, तरल पदार्थ केवल नीचे टुकड़ा संस्कृति डालने ऊपर और गैस विनिमय जोखिम) विन्यास जरूरी है मतलब है 1,2 दूसरा, तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें. एसडी लेकिन उनकी तैयारी से आघात के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 95% ऑक्सीजन वातित के उपयोग को बनाए रखने है घंटी समाधान समर्थक भड़काऊ परिवर्तन और epileptiform व्यवहार क्रमशः, जो तंत्रिका सर्किट समारोह और प्रतिरक्षा homeostasis 3 तीसरा बदल. सकते हैं उत्पन्न, जबकि hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों इन तीव्र टुकड़ा सीमाओं पर काबू पाने, यह महत्वपूर्ण है है कि टुकड़ा संस्कृतियों से पहले पर्याप्त अवधि के लिए बनाए रखा जा चाहिए (यानी, इन विट्रो में अधिक से अधिक 10 दिन) का उपयोग करें ताकि microglia और astrocytes मौन हो 3-5 अंत में, एसडी बाँझ और सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर प्रेरित किया जाना चाहिए. . नीचे दिये तकनीक इस जरूरत को पूरा करने के लिए डिजाइन किए हैं. 1. स्लाइस संस्कृतियों में अवसाद फैल संस्कृति की तैयारी और रखरखाव. स्लाइस संस्कृतियों तैयार कर रहे हैं और घोड़े के सीरम आधारित मध्यम या सीरम मुक्त मध्यम (SFM) 6,7 के रूप में पहले 8 मध्यम मामूली संशोधनों के साथ वर्णित में बनाए रखा. ऊष्मायन पैरामीटर 36 डिग्री सेल्सियस, 5% 2 सीओ, 95% हवा नमी संतुलन. हम पाते हैं कि इन विट्रो में 18 दिनों के बाद संस्कृतियों SFM के लिए बंद किया जा सकता है और हमारे पहले से परिभाषित SFM का उपयोग है कि अतिरिक्त कैल्शियम और मैग्नीशियम शामिल इन विट्रो में कम से कम 35 दिनों के लिए बनाए रखा. इसके अलावा, एंटीबायोटिक दवाओं और एक antifungicide संक्रामक एकाधिक रिकॉर्डिंग एपिसोड के साथ जुड़े संदूषण रोकने के लिए जोड़ रहे हैं. यह लंबी अवधि के रिकॉर्डिंग (या) मध्यम तैयार हैं (100 एमएल प्रति): Neurobosal मध्यम, 97 एमएल, रत्न 21, 2.0 एमएल, Glutamax (200 मिमी), 0.5 एमएल, Gentamycin (10 मिलीग्राम / एमएल), 10 μL; डी (45%) ग्लूकोज, 680 μL, ascorbic एसिड (0.5 एम), μL 100; Fungizone (250 मिलीग्राम / एमएल), 400 μL, NaCl (5.0 एम), 820 μL, 2 मिलीग्राम 2 सीएल (1.0 एम) , 80 μL; CaCl 2 (एम 1.0), 160-240 μL. संस्कृतियों एसडी के लिए इन विट्रो में 21-35 दिन से इस्तेमाल कर रहे हैं. जीवन शक्ति सत्यापन. 3,6,7 संस्कृतियों उपयोग करने से पहले पिरामिड न्यूरॉन मौत का सबूत के लिए जांच कर रहे हैं. इन विट्रो में 18 दिनों में, आवेषण माध्यम में 20 मिनट (सामान्य ऊष्मायन शर्तों के अधीन) 5 सुक्ष्ममापी Sytox ग्रीन, एक मार्कर है जो फ्लोरोसेंट जब यह डीएनए (यानी, मृत कोशिकाओं में प्रवेश करके) को बांधता हो जाता है युक्त के लिए incubated हैं. आवेषण तो उनके पिछले मध्यम वापस स्थानांतरित और CA3 या CA1 पिरामिड न्यूरॉन परत चोट के सबूत के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (504 उत्तेजना और उत्सर्जन 523) के साथ जांच. 20 से अधिक कक्षों या 250 आइयू की तुलना में प्रतिदीप्ति अधिक से अधिक एक मानकीकृत स्तर के साथ स्लाइसें आगे उपयोग से निकाल दिए गए थे. सामग्री निर्माण. ग्राउंड इलेक्ट्रोड ग्लास (2.0 मिमी आयुध डिपो / 1.16 मिमी आईडी) 4.5 मिमी लंबाई करने के लिए कटौती ट्यूबों के साथ बना रहे हैं और संक्षिप्त दोनों सिरों पर पॉलिश आग . हम एक समय में के बारे में 20 इलेक्ट्रोड है, जो एक साल से भी अधिक के लिए पिछले कर सकते हैं बनाते हैं. लाओ फोड़ा करने के लिए 1M KCl के 100 एमएल और क्रियाशीलता, 3.5 ग्राम अगर और 0.5 ग्राम EDTA (ethylenediaminetetraacetic एसिड disodium नमक dihydrate) के साथ जोड़ने के लिए, एक स्पष्ट पीला समाधान का उत्पादन. प्रत्येक ग्लास ट्यूब पर लगे कांच के रूप में अच्छी तरह से लचीला टयूबिंग में एक छोटी दूरी ट्यूबों में गर्म समाधान / KCl अगर आकर्षित लचीला टयूबिंग की एक छोटी लंबाई का उपयोग करें. रिलीज चूषण और KCl / अगर धीरे ड्रिप एक ग्लास ट्यूब के खुले सिरे से बाहर की अनुमति है, तो बर्फ का एक टुकड़ा के खिलाफ खुला ग्लास ट्यूब टिप पकड़ है. इलेक्ट्रोड टिप पर उत्तरार्द्ध पैंतरेबाज़ी अगर जेल करने के लिए संकेत देगा जेल नहीं शीशे की नली में ऊपर वापस घटता के बाद. एक बार अगर ठंडा चल रहा पानी में gelled है, लचीला ट्यूब कांच नलियों में तैनात अगर फेरबदल के बिना हटाया जा सकता है है. जगह एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब रैक में से प्रत्येक के कुएँ में 0.5 1 एम KCl की एमएल. फिर प्रत्येक / KCl अगर भरा ग्लास ट्यूब व्यक्तिगत कुओं में से एक टिप जगह है. अगले, एक hemostat के साथ एक 15 गेज चांदी के तार के 80 सेमी लंबाई पकड़ और एक एमरी बोर्ड के माध्यम से तार scraping काउंटर शीर्ष करने के लिए आयोजित चार पक्षों के प्रत्येक साफ. 4 सेमी लंबाई में तार कट और उन्हें एक जगमगाहट 20-30 मिनट के लिए ब्लीच से भरा साफ चांदी की सतह पर एक फर्म कोट एजी-AgCl जगह शीशी में जगह. छमाही में प्रत्येक तार बेंड और वाई भरा गिलास ट्यूब के अंत में मुफ्त समाप्त होता सम्मिलितवें KCl / अगर, के बारे में 4-6 मिमी उजागर छोड़ने. अंत में, कोट ग्लास ट्यूब टांग चांदी के तार और तार के गूप के साथ एक छोटे हद तक, एक पानी प्रतिरोधी और लचीला गोंद, सूखने से रोकने के KCl / अगर युक्त. सभी इलेक्ट्रोड के लिए दोहराएँ. चलो गोंद रातोंरात सूखे. 4 में इलेक्ट्रोड स्टोर ° जगमगाहट शीशियों में सी (5-6 इलेक्ट्रोड / शीशी) ~ 5 एमएल 1 एम KCl और EDTA है, जो स्पष्ट रूप से बैक्टीरियल विकास अवरूद्ध के 25 मिलीग्राम से युक्त. Filaments (वीडियो चित्रा 1) के साथ borosilicate ग्लास ट्यूबों, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड 1.5 मिमी (10 सेमी लंबाई 0.86 मिमी आईडी) व्यास से बना रहे हैं . छोटे ग्लास ट्यूब के साथ एक अच्छा टिप एक तेज बिंदु करने के लिए खींच लिया microelectrodes खींचो. हम आम तौर पर इलेक्ट्रोड खींच ~ लंबाई में 1 सेमी की घटना के साथ 7.5 सेमी. यह पर्याप्त स्थिति और इलेक्ट्रोड टिप दृश्य की अनुमति देता है. इलेक्ट्रोड एक Narishige पीई 2 खींचने के साथ खींच रहे हैं. Microelectrode सुझावों वापस दृश्य के तहत 2-4 सुक्ष्ममापी एक परिसर में एक calibrated ऑप्टिकल सुक्ष्ममापी साथ फिट खुर्दबीन का उपयोग करने के लिए टूट रहे हैं. हम एक मानक कांच ऊतक विज्ञान स्लाइड के किनारे (25 x x 1 मिमी 75) एक हाइड्रोलिक एक आयामी धीरे microelectrode सुझावों को तोड़ने के लिए एक और 3 आयामी जोड़तोड़ द्वारा आयोजित micromanipulator से जुड़ी का उपयोग करें सबसे पहले, इलेक्ट्रोड मुहिम शुरू की है एक खुर्दबीन का उपयोग कर स्लाइड मिट्टी से जुड़ी है. तब स्लाइड खुर्दबीन स्लाइड धारक जो गिरावट हाइड्रोलिक जोड़तोड़ से जुड़ी कांच के किनारे के पास microelectrode टिप चाल के लिए इस्तेमाल किया जाता है पर रखा गया है. अंत में, microelectrode की नोक धीरे यह hydraulically प्रेरित खुर्दबीन स्लाइड के किनारे के खिलाफ दबाकर टूट गया है. उत्तेजक इलेक्ट्रोड तार द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड क्योंकि मुड़ रहे हैं: वे क्षेत्र क्षमता पैदा की है, जो अन्यथा monopolar उत्तेजना से उत्तेजना artifact के द्वारा obscured होगा की रिकॉर्डिंग की अनुमति देते हैं. एक द्विध्रुवी उत्तेजक इलेक्ट्रोड धीरे चोट के बिना दांतेदार गाइरस सतह के लिए लागू किया जा सकता है तेज इत्तला दे दी द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड के विपरीत,. अंत में, वर्तमान लागू किया जाता है Teflon अछूता इलेक्ट्रोड के लिए इस्तेमाल किया तार के अनुप्रस्थ (नंगे) परिपत्र सतहों के लिए स्थानीयकृत. और Teflon लेपित तार, उत्तेजक इलेक्ट्रोड निर्माण ~ 20 सेमी लंबाई (200 सुक्ष्ममापी लेपित व्यास 125 सुक्ष्ममापी नंगे व्यास) प्लैटिनम iridium के काटने के साथ शुरू होता है. फिर, आधा लंबाई में मोड़ और ढीला समाप्त होता है एक ढीला वर्ग गाँठ में टाई, गाँठ से ~ 2 सेमी तार का छोर तक छोड़ने. एक मेज पर रखा एक बिजली के हाथ ड्रिल के चक में गाँठ को सुरक्षित करो. जबकि एक hemostat के साथ तार के दूसरे छोर पकड़े, संक्षेप में ड्रिल मोड़ पर और बंद जब तक तार कसकर मुड़ जाता है (यानी, प्रत्येक कटौती की सतह जब अनुप्रस्थ दिशा में unraveling बिना तार काट रहा है दूसरे से समान दूरी होगा ). अगले, प्लैटिनम iridium मुड़ तारों के नंगे छोर करने के लिए एक उत्तेजना अलगाने उत्तेजक इलेक्ट्रोड कनेक्ट करने के लिए इस्तेमाल किया तार का नेतृत्व करने के लिए संलग्न किया जाना चाहिए. यह प्लैटिनम iridium ~ 50 सेमी 30 गेज तार तार की सोल्डर मुक्त समाप्त होता है के द्वारा किया जाता है. सबसे पहले, एक बेंच शीर्ष और एक मुड़ तार के मुक्त अंत पर केंद्रित एचसीएल के एक पोखर ड्रॉप करने के लिए प्लैटिनम iridium मुड़ तार टेप. अगला, प्रत्येक एक तार कटर का उपयोग तार से 1 सेमी के बारे में इन्सुलेशन के बंद पट्टी. मुड़ तार अंत करने के लिए निकट से एक का नेतृत्व तार पर छीन अंत प्लेस और एक ठीक इत्तला दे दी टांका लोहे से गर्मी लागू है, तो मिलाप जब तक दो तारों को मजबूती से जुड़े होते हैं. उजागर तार कनेक्शन से अधिक हटना गर्मी टयूबिंग की एक छोटे लंबाई स्लिप और हटना गर्मी के साथ फिट. दूसरे तार के लिए दोहराएँ. एक 15 सेमी पाश्चर पिपेट की नोक आग पॉलिश और विंदुक नीचे मुड़ protrudes के बारे में 6 सेमी बाहर तक मुड़ प्लैटिनम iridium तार गाइड. पानी विकर्षक epoxy (जैसे, जेबी वेल्ड) का उपयोग करने के लिए इलेक्ट्रोड के दोनों सिरों मुहर. अंत में, केले प्लग उत्तेजना अलगाने के लिए कनेक्शन के लिए नेतृत्व तार छोर तक देते हैं. त्रिविम प्रेक्षण के तहत, पीबीएस में इलेक्ट्रोड टिप जगह और electrolytically उत्पादन केवल इलेक्ट्रोड सुझावों की कटौती अंत से आ रही बुलबुले के लिए देखो. यदि किसी भी बुलबुले मुड़ तारों की तरफ से आते हैं, एक अनुप्रस्थ पुनः स्थापित बरकरार इन्सुलेशन तार लंबे अक्षों के लिए एक ताजा एकल बढ़त धार का उपयोग कर कटौती के साथ इलेक्ट्रोड काटा. जब न्यायपालिका उत्तेजना प्रभाव को हल करने के लिए समस्या निवारण की आवश्यकता है, एक ताजा कटौती इलेक्ट्रोड टिप बनाने की कोशिश करें. रिकॉर्डिंग व्यंजन रूप से मिलकर बनता हैजूँ एक 35 मिमी संस्कृति डिश है कि दो 1.0 x 12 मिमी कांच के बारे में 1.0 सेमी अलग स्थान छड़ पर बैठता में संस्कृति डालने. पकवान आधार ग्लास ट्यूब हीटिंग और फिर उन्हें संदंश के साथ बेस में दबाव द्वारा कांच की छड़ संलग्न. स्थिर रिकॉर्डिंग स्थितियों के लिए, पकवान करने के लिए माध्यम की 1.5 एमएल जोड़ें. अगले माध्यम की 1.0 एमएल में बाँझ कपास की एक ~ 10 मिमी चौड़े और 3-4 सेमी लंबा टुकड़ा लेना. लंबे अक्ष के साथ आधे में कपास मोड़ो और भीतर अच्छी तरह से साथ यह बाँझ संदंश के साथ डालने पर जगह है. गीला कपास पकवान नमी बनाए रखने के में मदद करता है. तीन सिकुड़ाया 4 मिमी टयूबिंग की लंबाई डालने के चारों ओर समान रूप से स्थान दिया गया है. Polyvinyl क्लोराइड फिल्म है, जो गैस आदान – प्रदान की अनुमति देता है है के साथ पकवान कसकर कवर. इसके मध्य ऊर्ध्वाधर दीवार के चारों ओर एक एकल बढ़त रेजर ब्लेड के साथ अतिरिक्त polyvinyl क्लोराइड फिल्म निकालने कट. Electrophysiological सेटअप एक टुकड़ा संस्कृति डालने विधानसभा electrophysiologic रिकॉर्डिंग के लिए PDMI रिकॉर्डिंग कक्ष में रखा गया है. डालने संस्कृति / PDMI कक्ष में पकवान विधानसभा रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड, मध्यम / अंतर्वाह बहिर्वाह ट्यूबों, आदि के लिए जरूरत के रूप में तैनात विभिन्न छोटे छेद के साथ, एक 2 मिमी मोटी प्लास्टिक डिस्क PDMI चैम्बर के साथ आपूर्ति के द्वारा कवर किया जाता है हम समय समय पर एक लघु संयोजन पीएच और टी thermocouple जांच एक मोहरबंद microelectrode अर्द्ध में घुड़सवार पीएच 7.3 और 36.0 ° सी स्थितियों को सुनिश्चित करने के एक लघु प्रकार के साथ इलेक्ट्रोड तापमान के साथ मध्यम पीएच की निगरानी. डालने / चैम्बर 5% कार्बन डाइऑक्साइड संतुलन हवा और मध्यम या तो स्थिर या (1.2 एमएल / मिनट) डालने के 35-36 में आयोजित केन्द्र के साथ प्रवाह विन्यास में आयोजित किया जाता है डिग्री सेल्सियस के साथ वातित है प्रवाह की स्थिति के लिए, मध्यम एक इनलाइन हीटर के साथ गरम है, फिर से 36 रिकार्डिंग कक्ष के केंद्र रखने डिग्री सेल्सियस एक दबाव से राहत के साथ एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप प्रणाली टुकड़ा संस्कृतियों में पंप से pulsations बिना माध्यम लाता है. एक PDMI चैम्बर के साथ आपूर्ति Aspirator कोमल चूषण के माध्यम से डालने से मध्यम हटाने के लिए प्रयोग किया जाता है. स्थिरता के लिए, कक्ष एक विशेष रूप से डिजाइन Burleigh जिब्राल्टर उल्टे खुर्दबीन मंच है कि एक औंधा माइक्रोस्कोप रखती है और एक कंपन मुक्त मेज पर बैठता है पर मुहिम शुरू की है. छोटे छेद एक छोटी सी, दाग़ना बैटरी चालित उपकरण के साथ polyvinyl क्लोराइड डालने लपेट के माध्यम से खोल रहे हैं. अगला, अगर एक प्रवाह विन्यास के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, Inlet और आउटलेट प्रवाह शुरू कर दिया है, एक जमीन इलेक्ट्रोड की नियुक्ति के बाद. अन्यथा, बस जगह में जमीन इलेक्ट्रोड डाल दिया. इलेक्ट्रोड, micromanipulators के साथ जगह में आयोजित की, बस के ऊपर एक टुकड़ा 5x बढ़ाई (1 छवि) पर एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ कल्पना तैनात हैं. उत्तेजक इलेक्ट्रोड के बाद रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के साथ शुरू करो. हम एक ऑडियो की निगरानी का उपयोग करने के लिए ध्यान दें जब microelectrode टुकड़ा के साथ संपर्क में आता है. टिप CA3 पिरामिड सेल शरीर परत के साथ मध्य में तैनात है. रिकॉर्डिंग शुरू कर रहे हैं, और तब उत्तेजक इलेक्ट्रोड धीरे दांतेदार गाइरस के midpoint सतह को छुआ है. दोनों मामलों में, प्रारंभिक इलेक्ट्रोड आंदोलनों मोटे नियंत्रण के साथ पूरा कर रहे हैं, और अंतिम स्थिति केवल हाइड्रोलिक, ठीक नियंत्रण के साथ चरण विपरीत रोशनी का उपयोग इतना है कि सेल शरीर परतों को आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. ~ प्रत्यक्ष सूक्ष्म दृश्य के तहत 25 सुक्ष्ममापी वेतन वृद्धि में अग्रिम इलेक्ट्रोड. एक बार जब इलेक्ट्रोड ऊतक स्पर्श, इलेक्ट्रोड एक और 20-30 सुक्ष्ममापी अग्रिम. रिकॉर्डिंग शुरू कर दिया हैं पहले उत्तेजक इलेक्ट्रोड जगह में डाल दिया है कुछ इस एसडी ट्रिगर नहीं करता है (यानी, एक यांत्रिक प्रोत्साहन के माध्यम से). ~ 10 मिनट बीत पहले के प्रयोगों से शुरू कर रहे हैं अनुमति दी जाती है. Transynaptically एसडी प्रेरित किया. ऑप्टिमाइज़ प्रकार (छवि 2) के रूप में CA3 क्षेत्र क्षमता पैदा की है. CA3 क्षेत्र संभावित 100 μs (0.2 हर्ट्ज) के एक वर्तमान है कि (जैसे, ~ 1-5 μA) एक प्रतिक्रिया ट्रिगर करने के लिए पर्याप्त है के साथ दालों शुरुआत के साथ पैदा कर रहे हैं. पिरामिड न्यूरॉन लंबे अक्ष के साथ वेतन वृद्धि में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड ले जाएँ जब तक क्षेत्र की क्षमता अधिक से अधिक है. फिर, इस स्थिति में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के साथ वर्तमान को बढ़ाने के लिए और अधिक से अधिक वर्तमान प्रतिक्रिया (जैसे, ~ 10-20 μA) नोट. अंत में, प्रयोगों के लिए अधिक से अधिक आधा उत्तेजना तीव्रता का उपयोग (जैसे, नकली नियंत्रण आवधिक उत्तेजना). Synaptically पैदा एसडी (छवि 2) के लिए सीमा निर्धारित करते हैं. साथ कॉन्फ़िगर इलेक्ट्रोड के रूप में पैदा क्षेत्र क्षमता के लिए ऊपर उल्लिखित, एकल, मैन्युअल रूप से पैदा फटने उत्तेजना प्रतिमान स्विच10 दालों (10 हर्ट्ज @ 100 μs / नाड़ी) की एक प्रतिमान पहले पूरे जानवरों के अध्ययन में लागू है. उत्तरोत्तर उत्तेजना फट प्रति वर्तमान तीव्रता में वृद्धि जब तक एसडी ट्रिगर है. उत्तेजनाओं के बीच कम से कम 60-120 सेकंड रुको. रिपोर्ट coulombs में एसडी दहलीज (यानी, वर्तमान एक्स समय). अन्य प्रयोगों है कि कई एसडीएस की प्रेरण के लिए प्रतिक्रियाओं को मापने की आवश्यकता होती है, एक उत्तेजना एसडी आह्वान संभावना शक्ति का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, ~ 100-500 नेकां). उत्प्रेरक एसडी एक घंटे के लिए हर 9 मिनट. प्रयोगों भर में सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें. पिछले एसडी के बाद, सामान्य ऊष्मायन शर्तों के संस्कृति डालने वापसी. संस्कृति डिश मार्क संस्कृति है कि एसडी अनुभवी नोट. हमारी आदत छोड़ दिया और टुकड़ा संस्कृति डालने के अधिकार के लिए दो अंक के लिए एक एकल निशान जगह है, # 1, # 2, और # 3 के रूप में सही करने के लिए छोड़ दिया से तीन संस्कृतियों के प्रत्येक टिप्पण है. संस्कृति फसल जब तक हर 3-4 दिनों मध्यम बदलें. आवर्तक एसडी के लिए, ऊपर उल्लिखित प्रक्रियाओं का पालन करें. हम आम तौर पर कई एसडीएस की एक शुरुआती घंटे के बाद एसडी दहलीज 1, 3, 7, और 14 दिनों में एक परिवर्तन के लिए परीक्षण. CA3 क्षेत्र तेजी से क्षमता और धीमी गति से संभावित परिवर्तनों अलग डिजिटल सिग्नल प्रोसेसिंग सिस्टम के माध्यम से दर्ज कर रहे हैं. 2. Hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों में अनुकरणीय महत्वपूर्ण इमेजिंग निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं (यानी, microglia) की गतिशील कार्य व्यवहार इसी तरह सेल चोट या प्रतिरक्षा सक्रियण (3 छवि) के बिना कर सकते हैं टुकड़ा संस्कृतियों में नजर रखी जा 9. उदाहरण के लिए, लेबल microglia उनके एसडी की synaptic गतिविधि में परिवर्तन के साथ जुड़े आंदोलन का आकलन करने के लिए, हम 4 isolectin आईबी fluorophore टैग का इस्तेमाल किया. पीबीएस (0.1 मिमी प्रत्येक CaCl 2, 2 MgCl, MnCl 2) के अतिरिक्त फैटायनों के साथ "lectin पीबीएस" के बाद द्विसंयोजक फैटायनों (0.1-1.0 मिमी) microglial कोशिका झिल्ली पर α – डी galactosyl moieties लेक्टिन बाँध के लिए आवश्यक हैं. "Lectin पीबीएस" का समाधान करें: 1 एल पीबीएस के लिए, सड़न रोकनेवाला तकनीक और बाँझ निस्पंदन का उपयोग जोड़ने के लिए, 1M 2 MgCl की μL 100 1M 2 MnCl की μL 100 1M 2 CaCl की μL 100 मिश्रण अच्छी तरह से गठबंधन और 4 में प्रशीतित रखने डिग्री सेल्सियस "लेक्टिन पीबीएस" के केवल 500 μL isolectin की शीशी प्रति की जरूरत है, लेकिन क्योंकि यह प्रशीतित हो सकता है और एक समय में महीनों के लिए रखा जा सकता है, यह बड़ी मात्रा बनाने के लिए उपयोगी हो सकता है. Reconstitute AlexaFluor (isolectin) isolectin IB4 lyophilized to1 मिलीग्राम / एमएल पाउडर "लेक्टिन पीबीएस" में 594 टैग. आदेश में photobleaching कम करने के लिए, इस कदम के रूप में जल्दी संभव प्रदर्शन, प्रकाश जोखिम को कम. Isolectin 20 μL aliquoted किया जा सकता है एक बार 1mg/ml पर पुनर्गठन और एक वर्ष के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा. 20 μg / विकास और 4-10 घंटे पहले इमेजिंग सामान्य ऊष्मायन शर्तों पर मध्यम सेते टुकड़ा संस्कृतियों में एमएल isolectin पतला. इमेजिंग सेट. माइक्रोस्कोप, शटर, कैमरा, प्रकाश, 2.0 तटस्थ घनत्व फिल्टर, 36 ° सी, गैस: 5% CO2, हवा (या 20% ऑक्सीजन, नाइट्रोजन संतुलन) इमेजिंग सेट अप के होते हैं. माइक्रोस्कोप, कैमरा, यूवी प्रकाश, तापमान नियंत्रण, और गैसों इमेजिंग से पहले कम से कम एक घंटे पर मुड़ें. MetaMorph इमेजिंग प्रोटोकॉल का सेट. "जर्नल" से ड्रॉप – डाउन मेनू, चुनने के जर्नल भागो …". यह पत्रिकाओं फ़ोल्डर, जिसमें से आप "मोशन डब्ल्यू var एएफएस (पत्रिका पहले से स्थापित है कि नीचे दिए गए चरणों का इस प्रकार) का चयन करना चाहिए के उद्घाटन के शीघ्र चाहिए," खोलें "क्लिक करें. "Autofocus आवृत्ति" अगले विंडो पॉप अप, संख्या 1 पर रखना होगा, "ठीक" पर क्लिक करें. अगला, सेटअप "अनुक्रमिक फ़ाइल … ना" पॉप अप विंडो, सब कुछ रखने के रूप में है: बेस नाम: छवि; छवि संख्या: 1; संख्या चौड़ाई: 3; प्रकार के रूप में सहेजें: MetaMorph झगड़ा; अगर छवि पहले से ही मौजूद है -> स्वचालित रूप से अधिलेखित; "का चयन करें निर्देशिका …", इस कारण होगा" फ़ोल्डर के लिए ब्राउज़ करें "विंडो पॉप अप करने के लिए क्लिक करें. यहाँ, (या कोई नया फ़ोल्डर बनाने के) फ़ोल्डर जहाँ फिल्म फ्रेम बचाया जाना चाहिए का चयन करें. तब, जब सही फ़ोल्डर (जैसे C: \ डेटा \ नया फ़ोल्डर) के तल में प्रदर्शित होता है "सेटअप अनुक्रमिक फ़ाइल ना …" खिड़की, क्लिक करें "ठीक है". मोल विंडो में: DiIMGBIN2 जा निचले बाएँ कोने में सेटिंग का चयन करें; "टाइम" एक्सपोजर: 20ms, "Binning": 1. फिर, विशेष टैब में: "मोड सेंसर": एफटी; "Digiti"zer: 10MHz (EM लाभ); "लाभ": Gain3 (3x); ओपन के लिए बेनकाब, साफ विधि:: स्पष्ट पूर्व ऍक्स्प, साफ गणना: 2, ट्रिगर मोड और लाइव ट्रिगर विधि: सामान्य (समय पर) कैमरा शटर; "45 EM लाभ" का चयन करें. "औसत के लिए फ्रेम्स": 3. पर क्लिक करें "बंद करो." MetaMorph इमेजिंग स्थापित करने के बाद, दो नीचे में 1 मिमी कांच की छड़ के साथ एक 35 मिमी संस्कृति डिश में डालने जगह है. रबर टयूबिंग की तीन 2 मिमी टुकड़े डालने और संस्कृति पकवान की दीवारों के बीच फिट करने के लिए आगे डालने स्थिर प्लेस. ~ 10 मिमी कपास डालने के अंदर एक अतिरिक्त 1 एमएल मध्यम में भिगो के लिए एक humidified वातावरण बनाए रखने की व्यापक टुकड़ा रखें. सुनिश्चित करें कि यह दीवारों के साथ फ्लश और hippocampal स्लाइस से दूर है. संस्कृति डिश के ऊपर कस polyvinyl क्लोराइड फिल्म के साथ द्रव नुकसान को रोकने के कवर. यकीन है कि इमेजिंग के ध्यान केंद्रित CA3 पिरामिड सेल परत है. 5x, 10x, और 20x चरण तस्वीरें लेने के द्वारा टुकड़ा अभिविन्यास नोट. "फोकस खोजें" खिड़की है कि स्क्रीन पर दिखाई देता है, सेट रेंज, वर्तमान + / – हो सकता है, "8" और सटीकता, माइक्रोन (ओं) में, "1" (नीचे में दोनों बक्से की जाँच की जानी चाहिए) . पर क्लिक करें "फोकस खोजें" एक छवि में फोकस सुनिश्चित. "Timelapse मोल" विंडो में, समय अंतराल के लिए "1 मिनट", और "6 घंटे" (ये हमारे पसंदीदा अधिग्रहण मापदंडों हैं) की अवधि का चयन करें. सही microglial आंदोलनों पर कब्जा करने के लिए, इमेजिंग कम एक बार प्रति मिनट की तुलना में अक्सर नहीं होना चाहिए. छवि संग्रहण ढेर का चयन करें. अद्यतन छवि विंडो बॉक्स, जाँच की जानी चाहिए, लेकिन अन्य दो बक्से के नीचे नहीं है. "खेला" चुनें "Lambda" हो. "ठीक" क्लिक करें. अब फिल्म को चलाने के लिए शुरू हो जाएगा. इसका मतलब यह होगा कि फिल्म खत्म जब तक या जब तक आप ईएससी, जिसके बाद फिल्म तो अगले समय अधिग्रहण कदम पर बंद हो जाएगा क्लिक करके फिल्म जल्दी रोक MetaMorph कार्यक्रम के भीतर कुछ नहीं किया जा सकता है. फिल्म के अंत में, Sytox के रूप में (एक) से ऊपर उल्लेख किया स्क्रीनिंग के द्वारा सेल की चोट के लिए जाँच करें. 3. निम्न – स्तर cytokine 11-15 संकेतन के लिए शाही सेना निकालना हम पहले से कम स्तर cytokine qPCR और पीसीआर सरणी तकनीक का उपयोग टुकड़ा संस्कृतियों में संकेत का पता लगाने के के लिए विस्तृत निर्देश प्रस्तुत 6,7. हम स्पष्ट रूप से साइटोकाइन टुकड़ा संस्कृतियों में mRNA पता लगाने के लिए हमारे दृष्टिकोण की संवेदनशीलता में सुधार है और इन सुधारों को यहां उपस्थित है. सुधार ऊतक फसल और शाही सेना के अलगाव के लिए हमारे दृष्टिकोण, ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNF-α) बदलने के लिए, और सीडीएनए preamplfication के लिए नमूनों की prescreening, जो ~ 6 बार पिछले तकनीकों की तुलना में अधिक संवेदनशील और कर रहे हैं, उदाहरण के लिए, के लिए पता लगाने की अनुमति टुकड़ा संस्कृति इंटरफेरॉन गामा (IFN-λ) का पहली बार पता लगाने. 15 पीसीआर तैयारी. स्लाइस संस्कृति फसल. निम्नलिखित प्रयोगों, टुकड़ा संस्कृति आवेषण 2-3 एमएल शाही सेना में डूबे हुए हैं बाद में और 4 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस आगे की प्रक्रिया जब तक 3 दिनों के लिए . फसल, बाहरी हटायें है (यानी, किसी भी उचित हिप्पोकैम्पस के लिए आसन्न ऊतकों) एक हीरे की चाकू का उपयोग करने के ऊतकों और व्यक्तिगत RNase / DNase मुक्त 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र 0.5 एमएल बाँझ खारा (पीबीएस) बफर फॉस्फेट युक्त ट्यूबों में स्लाइस ठीक इत्तला दे दी पेंट का उपयोग लिफ्ट ब्रश. एक stereotypic फैशन में स्पिन नमूने (दस हज़ार rpm x 1 मिनट) तो सभी स्लाइस उनके ट्यूबों के एक ही पक्ष के लिए पालन. 500 μL TRIzol में पीबीएस सतह पर तैरनेवाला और resuspend नमूना निकालें. स्टोर नमूने -80 डिग्री सेल्सियस या शाही सेना निकासी जब तक बर्फ पर रहते हैं. RNeasy अकेले किट के उपयोग की तुलना में अधिक से अधिक शाही सेना उपज (4 छवि) में माइक्रो किट परिणामों के साथ शाही सेना निष्कर्षण usingTRIzol. TRIzol नमूने पहले गला लें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं. नमूने ड्राइंग और 1 एमएल के साथ नीचे के ऊतकों को अलग कर देना pippetor और / या vortexing इत्तला दे दी है जब तक ठोस ऊतक नहीं रह गया है दिखाई. जोड़ें 100 μL RNase मुक्त क्लोरोफॉर्म (आरएफ) और ट्यूब 2-3 बार करने के लिए मिश्रण को पलटना. कमरे Temp में 3 मिनट सेते हैं, हर मिनट vortexing. 4 में 15 मिनट के लिए 13,000 rpm पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस एक साफ 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब करने के लिए सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण. इंटरफ़ेस परेशान नहीं सावधान रहो. आरएफ 70% आणविक जीव विज्ञान ग्रेड इथेनॉल (~ 300 μL) कमरे के तापमान के एक समान मात्रा में जोड़ें. Pipetting और नीचे एक बार कुछ धीरे मिलाएं. RNeasy माइक्रो किट निर्देशों के अनुसार निम्न चरणों के साथ जारी रखें: एक RNeasy सूक्ष्म 2ml collectio में रखा स्तंभ नमूना लागूपता ट्यूब. 15 सेकंड के लिए 10,000 rpm पर अपकेंद्रित्र, प्रवाह के माध्यम से त्यागें. 350 μL बफर RW1 RNeasy स्तंभ के साथ धोएं. 15 सेकंड के लिए 10,000 rpm पर अपकेंद्रित्र, प्रवाह के माध्यम से त्यागें. 10 उल DNase 1 70 μL बफर RDD शेयर का हल जोड़ें, धीरे मिश्रण. सीधे DNase समाधान के 80 μL झिल्ली पर लागू करें और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. 350 μL बफर RW1 RNeasy स्तंभ के साथ धोएं. 15 सेकंड के लिए 10,000 rpm पर अपकेंद्रित्र, प्रवाह के माध्यम से और ट्यूब त्यागें. 500 μL बफर RPE RNeasy स्तंभ जोड़ें. 15 सेकंड के लिए 10,000 rpm पर अपकेंद्रित्र, प्रवाह के माध्यम से त्यागें. RNeasy स्तंभ 500 μL आरएफ 80% आणविक जीव विज्ञान ग्रेड इथेनॉल जोड़ें. 2 मिनट के लिए 10,000 rpm पर अपकेंद्रित्र, प्रवाह के माध्यम से और ट्यूब त्यागें. नए ट्यूब में खुला टोपी के साथ RNeasy स्तंभ रखें. 5 मिनट के लिए पूर्ण गति (यानी, 14,000 rpm) अपकेंद्रित्र. एक आरएफ microcentrifuge ट्यूब RNeasy स्तंभ स्थानांतरण. 14 μL आरएफ पानी सीधे झिल्ली को लागू करें. 1 मिनट elute के लिए 10,000 rpm पर अपकेंद्रित्र. -80 पर स्टोर के नमूने ° या अगले कदम के लिए जारी रखने के सी. शाही सेना मात्रा का ठहराव. आरएफ Tris EDTA 1x में RiboGreen 1:200 (ते) बफर पतला. खमीर के लिए शाही सेना के मानक के रूप में इस्तेमाल किया जा tRNA तैयार. कार्य शेयर -20 डिग्री सेल्सियस में 100 μg / एमएल पर संग्रहीत है 1 μg / एमएल (990 μL ते में 10 μL) के लिए पतला. मानकों के रूप में बनाएँ: 100 के लिए एनजी / μL 100 μL जोड़ने के लिए, 80 के लिए एनजी / μL, 80 μL tRNA और 20 μL ते जोड़ने के लिए 60 एनजी / μL, 60 μL tRNA और 40 μL ते जोड़ने के लिए, 40 एनजी / μL 40 μL tRNA और 60 μL ते जोड़ने के लिए, के लिए 20 एनजी / μL 20 μL tRNA और 80 μL ते जोड़ने के लिए, और 0 के लिए एनजी / μL 100 μL ते जोड़ने. नमूने की तैयारी: 99 μL ते + 1 μL नमूना मिश्रण. दो प्रतियों में प्रत्येक नमूना चलाएँ. एक pipettor मल्टी चैनल का प्रयोग, पतला RiboGreen के 100 μL प्रति अच्छी तरह से जोड़ें. पिपेट और नीचे मिश्रण करने के लिए. एक थाली पाठक पर प्रतिदीप्ति उपाय. Fluorescein कार्यक्रम (485 nm/535 एनएम, 0.1 सेकंड). एक एक्सेल स्प्रेडशीट में परिणाम निर्यात. शाही सेना एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. ग्राफ़ absorbency बनाम आरएनए एकाग्रता और एक सबसे अच्छा फिट Excel में रेखीय प्रतिगमन लाइन बनाने. प्रतिगमन सबसे अच्छा फिट रेखा के साथ जुड़े समीकरण से नमूना शाही सेना सांद्रता का निर्धारण करते हैं. शाही सेना गुणवत्ता का निर्धारण करते हैं. Ribosomal शाही सेना बैंड अखंडता agarose जेल (4 छवि) के माध्यम से मापा जाता है. हालांकि यह प्रत्येक शाही सेना के नमूने के एक अंश प्राप्त (= 1 शाही सेना के μg आवश्यकता होती है और हमारे पैदावार छोटे हैं के बाद से) चलाने के लिए अव्यावहारिक है, यह एक अनुकरणीय नमूना पर समय – समय पर सबूत के रूप में एक denaturing agarose जेल चलाने के लिए एक अच्छा विचार है कि विधि , उच्च गुणवत्ता शाही सेना (यानी, गिरावट के बिना), जब ठीक से किया पैदावार. एक 1% agarose जेल (100 एमएल मात्रा के लिए) तैयार करें. साफ वैद्युतकणसंचलन टैंक, ट्रे और RNase साथ जेल कंघी अच्छी तरह से दूर कास्टिंग. एक कुप्पी में ultrapure agarose के एक ग्राम वजन. RNase मुफ्त पानी और 10x MOPS के 10 एमएल के 83 एमएल जोड़ें [3 – (एन morpholino) propanesulfonic एसिड] बफर और माइक्रोवेव जब तक agarose भंग है और समाधान स्पष्ट है (~ 3 मिनट). 10x MOPS बफर बनाने 83.7 छ MOPS, 13.6 ग्राम सोडियम एसीटेट, और 3.7 छ EDTA का मिश्रण. RNase मुफ्त पानी के 800 एमएल जोड़ें, भंग करने के लिए मिश्रण. 7.0 पीएच समायोजित और 1 एल को भरने बाँझ या आटोक्लेव फ़िल्टर. कमरे के तापमान पर स्टोर, प्रकाश से रक्षा की. जेल 55 से शांत करने के लिए अनुमति दें डिग्री सेल्सियस और 7 एमएल 37% formaldehyde (इस कदम के एक रासायनिक धूआं हुड में किया जाना चाहिए है) में जोड़ें. ट्रे कास्टिंग में जेल डालो और जेल करने की अनुमति हुड में जमना. शाही सेना के नमूने तैयार. शाही सेना नमूना बफर (500 μL, ताजा बनाने). 50 μL 10x MOPS, 250 μL formamide, 90 μL 37% formaldehyde, 108 μL आरएफ एच 2 हे और 2 μL ethidium ब्रोमाइड (स्टॉक समाधान 10 मिलीग्राम / एमएल) का मिश्रण. शाही सेना के 1-10 μg करने के लिए, डबल इसकी मात्रा नमूना बफर का उपयोग एक तीन गुना कमजोर पड़ने के लिए, जोड़ने. 95 में denature ° सी, 5 मिनट के लिए और फिर 5 मिनट के लिए बर्फ पर ठंड. स्पिन briefly और कुओं में एक शाही सेना सीढ़ी के बगल में पूर्ण नमूना (लोडिंग डाई जोड़ अगर वांछित) लोड. Electrophorese 1x MOPS बफर के साथ चैम्बर भरें. Electrophorese मार्करों जब तक 50-75 वोल्ट पर 2/3rd जेल की लंबाई के बारे में चले गए हैं. एक यूवी transilluminator पर जेल कल्पना. सत्यापित करें कि वहाँ तेज 18s और 28S ribosomal शाही सेना बैंड (rRNA) कर रहे हैं, और है कि 28S बैंड दो बार के रूप में 18s बैंड (4 छवि) के रूप में तीव्र है. अपमानित शाही सेना लिप्त उपस्थिति, फजी बैंड है, या एक 2:1 के अनुपात प्रदर्शन नहीं होगा. आमतौर पर हम ऑप्टिकल घनत्व का उपयोग करने के लिए कुल शाही सेना गुणवत्ता का आकलन. हालांकि के रूप में संवेदनशील नहीं है, एक Nanodrop के माध्यम से यूवी spectrophotometry शाही सेना गुणवत्ता की जाँच का एक त्वरित और लागत प्रभावी का मतलब है. ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) 260/280 1.5-2.0 के अनुपात के लिए देखो. ध्यान रखें कि समाधान में जो शाही सेना (ते बफर बनाम पानी) resuspended है आयुध डिपो अनुपात को प्रभावित करेगा. पीसीआर गतिविधियों. प्री – पीसीआर सेटअप विशिष्ट प्राइमरों डिजाइन NCBI Primerblast का उपयोग http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ : लक्ष्य जीन Refseq परिग्रहण संख्या दर्ज करें. 70 से 200 बीपी पीसीआर उत्पाद का आकार निर्दिष्ट करें. आगे और रिवर्स प्राइमरों के बीच कम से कम 5 ° अंतर के साथ 55-72 डिग्री के tm, निर्दिष्ट करें. चुनें "प्राइमर एक एक्सॉन – एक्सॉन जंक्शन अवधि चाहिए" जीनोमिक पृष्ठभूमि को कम. चूहा Refseq आरएनए करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्राइमरों अतिरिक्त लक्ष्य को पहचान नहीं है डेटाबेस के लिए विशिष्टता चेक सक्षम. परिणामों से एक प्राइमर जोड़ी है कि निम्नलिखित मानदंडों को फिट बैठता है चुनें: लंबे समय 18-30 कुर्सियां. अपने टेम्पलेट पर 2000 अलग ठिकानों से कम. 40-60% guanine साइटोसिन प्राइमर के स्थिर टेम्पलेट के लिए बाध्य सुनिश्चित सामग्री. एक संदर्भ जीन का चयन. नहीं हर संदर्भ जीन अपने प्रयोगात्मक सेट के लिए उपयुक्त हो जाएगा. हर बार एक नए प्रतिमान प्रयोग किया जाता है, आपके संदर्भ की स्थिरता को सत्यापित किया जाना चाहिए. स्थिरता के लिए, हम एक चार संदर्भ RT 2 Profiler पीसीआर सरणी पर प्रदान जीनों के उपयोग का विकल्प चुना . एक अच्छा संदर्भ जीन निम्नलिखित मानदंडों को पूरा करना चाहिए: इसकी अभिव्यक्ति के स्तर प्रयोगात्मक प्रतिमान बदल नहीं है. यह लक्ष्य जीन के समान स्तर पर व्यक्त की है. एक उपयुक्त संदर्भ का चयन करें: साहित्य की समीक्षा करने के लिए अपने सिस्टम में एक स्थिर संदर्भ जीन के लिए उम्मीदवारों की संभावना की पहचान के लिए. उदाहरण के लिए, हम Rpl13a परीक्षण किया है क्योंकि यह ischemia के अध्ययन में स्थिर हो दिखाया गया था. 11,12 डिजाइन प्राइमरों के रूप में ऊपर चर्चा की (या RTPrimerDB तरह एक डेटाबेस में आम संदर्भ जीनों के लिए पहले से ही मान्य प्राइमरों मिल http://www.rtprimerdb.org/ ). लक्ष्य जीन प्राइमरों के बगल प्राइमरों ऑप्टिमाइज़ (नीचे देखें). निर्धारित जो उम्मीदवार संदर्भ सबसे अधिक स्थिर है (http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm) Normfinder जो intragroup विचरण के आधार पर प्रत्येक जीन के लिए एक स्थिरता मूल्य की गणना है और कम से कम अभिव्यक्ति के साथ जीन (एस) का चयन जैसे सॉफ्टवेयर का उपयोग नमूने से अधिक भिन्नता है. उदाहरण के लिए, Rpl13a एसडी (4 छवि) के लिए एक इष्टतम संदर्भ जीन है . प्राइमरों ऑप्टिमाइज़. QPCR से सुसंगत और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, प्राइमरों के reproducibility है, संवेदनशीलता और विशिष्टता, के कुछ मानदंडों को पूरा है. यह सबसे अच्छा है के लिए प्रत्येक नई प्राइमर जोड़ी के लिए इन मानकों का परीक्षण. Reproducibility के लिए चल तकनीकी replicates द्वारा परीक्षण किया है. संवेदनशीलता लगातार चार गुना dilutions की एक मानक वक्र के साथ प्रदर्शन से मूल्यांकन किया जा सकता है. विशिष्टता पिघल वक्र विश्लेषण और जेल वैद्युतकणसंचलन (5 छवि) द्वारा एक एकल उत्पाद की पुष्टि के द्वारा निर्धारित किया जाता है. QPCR के लिए अपने प्राइमरों की गुणवत्ता का परीक्षण, प्लेट और के लिए इस्तेमाल किया जा प्राइमरों की एकाग्रता चलाएँ. 1, 1:04, 1:16, 1:64, 1:256, और कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी): पूरे मस्तिष्क शाही सेना से संश्लेषित सीडीएनए का उपयोग, के रूप में एक मानक (लगातार 4 गुना dilutions की श्रृंखला) वक्र बनाने . प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए, duplica में एक सीडीएनए μL चलाएँप्राइमरों के प्रत्येक एकाग्रता, (यानी, 100 एनएम, 200 एनएम, 300 एनएम) के लिए ते. पुष्टि करें कि तकनीकी के अनुरूप सीटी मूल्यों दे प्रतिकृति. कमजोर पड़ने वक्र के लिए सीटी मूल्यों की जांच. सीटी मूल्यों dilutions में से प्रत्येक के लिए एकाग्रता के खिलाफ साजिश है. परिणामी ग्राफ एक अच्छा सहसंबंध गुणांक (यानी> 0.95) के साथ रैखिक होना चाहिए. पिघल वक्र के लिए एक एकल प्रवर्धन उत्पाद की उपस्थिति (यानी, एक चोटी) की पुष्टि के लिए जांच करते हैं. अगर वहाँ कई चोटियों हैं, या चोटियों समान नहीं हैं, यह संदूषण, mispriming, artifact के प्राइमर – डिमर, आदि (छवि 5) का सुझाव हो सकता है . एनटीसी में एक चोटी की संभावना प्राइमर dimers जो सीडीएनए टेम्पलेट के अभाव में और अधिक आसानी से फार्म के अनुरूप होगा, और एक चिंता का विषय नहीं होना चाहिए. एक 1% agarose जेल पर परिलक्षित उत्पादों को हल करने के द्वारा पिघल वक्र डेटा की पुष्टि करें. एक 1% agarose जेल (100 एमएल मात्रा के लिए) तैयार एक कुप्पी में agarose के एक ग्राम वजन. 1x Tris-एसीटेट EDTA (TAE) बफर और माइक्रोवेव जब तक agarose भंग है और समाधान स्पष्ट है की 100 एमएल जोड़ें. 1 एल 50x TAE बफर 2 एम Tris आधार, 57 एमएल हिमनदों एसिटिक एसिड, और 0.05 एम EDTA (8.0 पीएच) के होते हैं. TAE बफर 1x करने के लिए आसुत जल (40 मिमी Tris-एसीटेट और 1.0 मिमी EDTA अंतिम सांद्रता) के साथ पतला. जेल ° 0.5 μg / एमएल के एक एकाग्रता के लिए ethidium ब्रोमाइड जोड़ने से पहले सी 55 के लिए शांत करने के लिए अनुमति दें. ट्रे कास्टिंग में जेल डालो और यह कमरे के तापमान पर जमना के लिए अनुमति देते हैं. चलाने के लिए, वैद्युतकणसंचलन 1x TAE से भरा कक्ष में जेल जगह, 6x लोड हो रहा है डाई के 2 μL के साथ qPCR थाली से नमूना के 10 μL गठबंधन, मिश्रण अच्छी तरह से और एक आणविक भार सीढ़ी के बगल में कुओं में लोड. 50-150 वोल्ट पर Electrophorese जब तक मार्कर एक उपयुक्त दूरी स्थानांतरित किया है, अपने सीडीएनए उत्पाद की उम्मीद आकार पर निर्भर करता है. एक यूवी transilluminator के साथ कल्पना. पुष्टि करें कि प्रवर्धित पीसीआर उत्पाद अपने लक्ष्य के लिए उपयुक्त आकार के है. प्राइमर dimers बीपी 50 के आसपास होगी. के लिए पूर्व स्क्रीन TNF-α वृद्धि हुई है. चूंकि TNF-α परिधि में सूजन प्रतिक्रियाओं शुरू है, हम संदेह है यह मस्तिष्क के लिए भी सच है और TNF-α टुकड़ा संस्कृति प्रतिरक्षा स्थिति (यानी, सामान्य, दिखावा, और प्रयोगात्मक समूहों) के एक मार्कर के रूप में mRNA के लिए आगे बढ़ने से पहले प्रारंभिक जांच का उपयोग करें पूरा पीसीआर सरणी विश्लेषण करने के लिए. यदि सामान्य और नकली नियंत्रण TNF-α mRNA स्तर एक interassay हमारी प्रयोगशाला प्रयोगों (यानी, सामान्य, दिखावा, और प्रयोगात्मक समूहों) के भीतर पाया सीमा के भीतर नहीं हैं त्याग कर रहे हैं और पूरा पीसीआर सरणी विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ना नहीं है. iScript सीडीएनए संश्लेषण. 20 μL के अंतिम मात्रा 4 μL 5x प्रतिक्रिया मिश्रण, 1 μL रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, 25 एनजी शाही सेना, और एच 2 आरएफ हे: प्रत्येक आरएनए नमूना के लिए, निम्न में से एक पीसीआर ट्यूब में गठबंधन. Pipetting द्वारा धीरे मिक्स और नीचे संक्षेप में स्पिन. सेते: 25 ° सी, 5 मिनट, 42 ° सी, 30 मिनट, 85 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट. 01:04 (60 μL RNase मुफ्त पानी जोड़ने) पतला. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या बर्फ पर रख जब तक घंटे के भीतर का उपयोग करने के लिए तैयार है. TNF-α के लिए qPCR. प्रत्येक प्राइमर जोड़ी के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करें. 12.5 μL बुद्धि SYBR हरे, 1 μL प्राइमर और नमूना प्रति 10.5 μL पानी के मिश्रण का मिश्रण. हमारे दोनों Rpl13a और TNF-α प्राइमरों के लिए, 200 एनएम इष्टतम एकाग्रता है. एक 1.5 एमएल आरएफ microcentrifuge ट्यूब में प्राइमरों और नुक़सान के लिए आवश्यक के रूप में मात्रा की राशि को समायोजित करें और बर्फ पर रख जब आप थाली सेट. नियंत्रणों experimentals / / शम्स के साथ qPCR थाली सेट. प्रत्येक जीन के लिए दो प्रतियों में 1 सीडीएनए प्रति नमूना की μL का प्रयोग करें. हर अच्छी तरह से अपने मास्टर मिश्रण के 24 μL जोड़ें और ऊपर और विंदुक नीचे मिश्रण. बहुत बुलबुले से बचने के लिए सावधान रहो, के रूप में वे प्रतिदीप्ति रीडिंग के साथ हस्तक्षेप करेगा. पीसीआर प्रवर्धन के 40 चक्रों चलाएँ: 95 डिग्री सेल्सियस, 8.5min; 40 चक्रों: 95 ° सी, सेकंड 10; 60 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड, 72 डिग्री सेल्सियस, 20 सेकंड / चक्र. वक्र पिगलो सी. ° 10 सेकंड के लिए 0.5 डिग्री सेल्सियस वेतन वृद्धि प्रत्येक 55 में शुरू के 80 चक्र, 55 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट: डेटा विश्लेषण (. ΔΔCt विधि; चित्र 4) 13. पीसीआर arrays के लिए सीडीएनए संश्लेषण. (ΜL) प्रत्येक नमूने की मात्रा की गणना करने के लिए शाही सेना के 250 एनजी है. (100 एनजी 1 μg) शाही सेना है कि आप लगातार अपने नमूनों से निकाल सकते हैं एक राशि चुनें. – आरटी 2 पहले Strand किट के रूप में निर्माता के निर्देशों के अनुसार. संक्षेप में: पहले गला लें और नीचे सभी अभिकर्मकों स्पिन. प्रत्येक शाही सेना नमूना के लिए, एक पीसीआर ट्यूब में निम्नलिखित गठबंधन: शाही सेना के 250 एनजी, 5x जीनोमिक डीएनए (gDNA) उन्मूलन बफर और 10 μL के अंतिम मात्रा करने के लिए पानी की 2 μL. Pipetting द्वारा धीरे मिक्स और नीचे संक्षेप में स्पिन. 42 ° 5 मिनट के लिए सी सेते हैं. 1 मिनट के लिए बर्फ पर शांत रहो. मतलब समय में, रिवर्स प्रतिलेखन कॉकटेल (आर टी) (प्रति नमूना) तैयार: 5x आरटी बफर 3, 1 μL प्राइमर और बाह्य नियंत्रण मिश्रण, 1 μL आरटी एंजाइम 3 मिश्रण है, और पानी की μL 3 4 μL मिश्रण. प्रत्येक नमूने के आरटी कॉकटेल के 10 μL जोड़ें और मिश्रण धीरे. 42 ° 15 मिनट के लिए सी सेते हैं. 95 में incubating डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो. प्रत्येक 20 μL सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया (111 μL के अंतिम मात्रा करने के लिए पतला) आरएफ एच 2 हे 91 μL जोड़ें. Pipetting द्वारा अच्छी तरह मिक्स. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या बर्फ पर रख जब तक घंटे के भीतर का उपयोग करने के लिए तैयार है. RT 2 Profiler पीसीआर सरणी. निम्नलिखित निर्माता के निर्देश का पालन करें और सुविधा के लिए यहाँ दोहराया. अभिकर्मकों की तैयारी पहले गला लें और नीचे सभी अभिकर्मकों स्पिन. प्रयोगात्मक कॉकटेल तैयार: 2x SABiosciences आरटी 2 qPCR SYBR ग्रीन मास्टर मिक्स, पतला सीडीएनए के 102 μL और आरएफ एच 2 हे μL 2700 के अंतिम मात्रा करने के लिए 1248 μL 1350 μL कम्बाइन. ध्यान से मोहरबंद बैग से पीसीआर सरणी हटा दें. एक लोडिंग जलाशय में कॉकटेल बग़ैर. प्रत्येक अच्छी तरह से एक pipettor मल्टी चैनल के साथ 25 μL जोड़ें. ध्यान मुहर पीसीआर सरणी थाली. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 10,000 rpm पर थाली अपकेंद्रित्र. पीसीआर कार्यक्रम जब तक बर्फ पर रखें तैयार है. अपनी मशीन के लिए उपयुक्त साइकिल चालन प्रोग्राम चलाएँ. iCycler: 95 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट 40 चक्रों: 95 डिग्री सेल्सियस, 15 सेकंड, 60 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट. वक्र पिगलो: 55 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट, 10 प्रत्येक 55 में शुरू डिग्री सेल्सियस सेकंड के लिए 80 चक्र 0.5 ° सी वेतन वृद्धि की डेटा का विश्लेषण. का चयन करें "आधारभूत चक्र के लिए ऑटो परिकलित". चुनें दहलीज स्थिति के लिए स्वयं दहलीज मूल्य सेट "उपयोगकर्ता परिभाषित". "प्रवेश करें देखें" में, कम प्रवर्धन साजिश के रैखिक चरण की एक तिहाई में सीमा निर्धारित है. दहलीज पर रन के पार एक ही मूल्य रखना सुनिश्चित करें. डेटा निर्यात. एक Excel फ़ाइल में इनपुट. SABiosciences पीसीआर ऐरे डेटा विश्लेषण करने के लिए अपलोड करें. http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php संदर्भ जीन का चयन करें – हम Rpl13a इस्तेमाल किया. हमारा अभ्यास करने के लिए है: कम से कम एक डुप्लिकेट पीसीआर सरणी के साथ परिणाम की पुष्टि करें. 3 गुना सरणी में परिवर्तन की जरूरत बाद में विशिष्ट लक्ष्य पीसीआर प्रवर्धन द्वारा पुष्टि नहीं 6,7. 2x परिवर्तन की पुष्टि करने से भी कम 3 गुना परिवर्तन के बाद विशेष लक्ष्य पीसीआर या पीसीआर 2-3 (सरणियों के प्रवर्धन उपयोग के द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए. पूर्व प्रवर्धन डीएनए उम्मीद अभिव्यक्ति अल्ट्रा कम (छवि 6) के साथ लक्ष्य का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. SABiosciences आरटी 2 नैनो preamp सीडीएनए संश्लेषण किट और प्राइमर घोला जा सकता है के पूर्व शाही सेना के प्रवर्धन के लिए इरादा कर रहे हैं करने के लिए छोटी मात्रा में (100-100 एनजी) के नमूना शाही सेना का उपयोग की अनुमति देने के लिए एक पूरा पीसीआर सरणी चलाने. प्रत्येक प्राइमर मिश्रण 89 जीन – विशिष्ट न्यूनतम पूर्वाग्रह के साथ सीडीएनए लक्ष्य टेम्पलेट्स का प्रवर्धन के लिए अनुमति देता है. हम एक detectible स्तर पर IFN-λ जैसे निम्न स्तर का संकेत amplifying के एक साधन के रूप में इस प्रणाली का इस्तेमाल किया है. आरटी नैनो 2 preamp सीडीएनए संश्लेषण किट के रूप में निर्माता के निर्देशों के अनुसार. संक्षेप में: पहले गला लें और नीचे सभी अभिकर्मकों स्पिन. प्रत्येक शाही सेना नमूना के लिए, एक पीसीआर ट्यूब में निम्नलिखित गठबंधन. शाही सेना के 1 100ng, 5x gDNA उन्मूलन बफर और 10 μL के अंतिम मात्रा करने के लिए पानी की 2 μL. Pipetting द्वारा धीरे मिक्स और नीचे संक्षेप में स्पिन. 42 ° 5 मिनट के लिए सी सेते हैं. 1 मिनट के लिए बर्फ पर शांत रहो. </li> इस बीच, आरटी कॉकटेल तैयार (नमूना प्रति). 5x आरटी बफर 3 4 μL, 1 μL प्राइमर और बाह्य नियंत्रण मिश्रण, 1 μL सीडीएनए एंजाइम संश्लेषण मिश्रण, 1 μL RNase अवरोध करनेवाला, और पानी की 3 μL मिश्रण. प्रत्येक नमूने के आरटी कॉकटेल के 10 μL जोड़ें और मिश्रण धीरे. 42 ° 15 मिनट के लिए सी सेते हैं. 95 में incubating डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या बर्फ पर रखने के लिए उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक. विशिष्ट प्राइमरों के साथ सीडीएनए प्रवर्धन. एक पीसीआर ट्यूब में निम्नलिखित मिक्स: 12.5 μL पीसीआर मास्टर मिश्रण, 7.5 μL विशिष्ट प्राइमरों, और undiluted सीडीएनए के 5 μL. पीसीआर प्रवर्धन के 12 चक्रों चलाएँ. 95 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट. 12 चक्र: 95 डिग्री सेल्सियस, 15 सेकंड, 60 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट. 4 में रुको डिग्री सेल्सियस प्रत्येक नमूने के लिए 2 μL पक्ष प्रतिक्रिया reducer जोड़ें. 37 ° 15 मिनट के लिए सी सेते हैं. 95 में incubating डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो. प्रत्येक 27 μL सीडीएनए प्रवर्धन प्रतिक्रिया के लिए 84 μL आरएफ पानी जोड़ें. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या बर्फ पर रख जब तक घंटे के भीतर का उपयोग करने के लिए तैयार है. सब प्राइमरों और SYBR हरी मास्टर मिश्रण के रूप में ऊपर वर्णित का उपयोग कर व्यक्तिगत जीन लक्ष्य बढ़ाना. 4. मल्टिप्लेक्स cytokine संकेतन के Phosphoprotein Assays Mutliplexed phosphoprotein assays के लिए ligand रिसेप्टर साइटोकाइन अनुप्रवाह संकेत (छवि 7) को परिभाषित किया जाता है . टुकड़ा संस्कृतियों में कुल प्रोटीन की मात्रा का निर्धारण करते हैं. हार्वेस्ट धीरे उठाने स्लाइस 1 एमएल ठंड में सम्मिलित करता है और जगह के द्वारा टुकड़ा संस्कृतियों (4 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस. 30 सेकंड और हटायें पीबीएस के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र. सूखी बर्फ पर रखें जब तक कटाई समाप्त हो गया. -80 पर स्टोर डिग्री सेल्सियस कुल प्रोटीन परख के लिए टुकड़ा संस्कृतियों homogenize. निर्माता के निर्देशों के अनुसार सेल lysis बफर तैयार. बफर की कुल मात्रा protease inhibitors जोड़ें lysis बफर के प्रत्येक टुकड़ा संस्कृति पर कम से कम 200 μL जगह की जरूरत है. उदाहरण के लिए: पहलू 1, 2, फैक्टर और DMSO में 500 मिमी PMSF के 20 μL 4.95 एमएल सेल lysis बफर के 10 μL के 20 μL जोड़ें. बर्फ पर 200 μL lysis बफर टुकड़ा संस्कृतियों में पहले गला लें. टुकड़ा संस्कृतियों 1 सेकंड दालों में पांच बार Sonicate और तुरंत बर्फ पर वापस जगह है. 10 सेकंड के लिए भंवर के नमूने. 4 में नमूने अपकेंद्रित्र ° १३००० rpm पर 15 मिनट के लिए सी. एक स्वच्छ ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और बर्फ पर रख. कुल प्रोटीन परख प्रदर्शन. प्रोटीन मानकों की तैयारी. Reconstitute शेयर निर्माता के निर्देशों के अनुसार गोजातीय albumin सीरम (BSA). 0-1000 μg / एमएल बीसीए प्रोटीन परख के लिए उच्च शुद्धता पानी में पतला से लेकर मानकों की तैयारी. काम अभिकर्मक की मात्रा परिकलित नमूनों की संख्या के आधार पर की जरूरत है और replicates. उदाहरण के लिए: (8 + मानक 18 अज्ञात नमूने) (2 नमूना प्रति प्रतिकृति) x (0.2 एमएल काम अच्छी तरह से प्रति आवश्यक अभिकर्मक) x = 10.4 एमएल कुल microplate पर लादा सभी नमूनों के लिए आवश्यक मात्रा. 12 एमएल कुल मात्रा को गोल करने के लिए पर्याप्त मात्रा सुनिश्चित करने. जब मिश्रण अभिकर्मक अभिकर्मक बी के साथ काम अभिकर्मक के लिए, एक कुछ turbidity हो सकता है, लेकिन जल्द ही गायब हो जाना चाहिए. नमूने और अच्छी तरह से प्रति मानकों के 10 μL लोड. कुओं में काम अभिकर्मक के 0.2 एमएल लोड. सील टेप के साथ कवर प्लेट और हिला के लिए 30 सेकंड मिश्रण करने के लिए. 37 पर डिग्री सेल्सियस 30 मिनट के लिए थाली सेते हैं. 595 एनएम तरंगदैर्ध्य पर एक प्लेट पाठक को पढ़ने से पहले कमरे के तापमान (10 मिनट) के बारे में कूल थाली. एक मानक वक्र उम्मीद एकाग्रता बनाम मापा absorbance के साथ Microsoft Excel का उपयोग कर निर्माण. एक अच्छा सहसंबंध गुणांक के बराबर या 0.98 से अधिक है. रेखीय समीकरण मानक वक्र से व्युत्पन्न का उपयोग कर के नमूनों में प्रोटीन सांद्रता की गणना. जब तक आगे प्रसंस्करण के लिए तैयार -80 में प्रोटीन और दुकान के बराबर मात्रा ° सी lysis बफर में नमूने पतला. प्रोटीन एकाग्रता 200-900 से μg एमएल / निर्माता के निर्देशों के अनुसार रेंज चाहिए. मल्टीप्लेक्स परख करें. नोट: मल्टिप्लेक्स phosphoprotein assays 2 दिन ले पूरा करने के लिए प्रारंभिक सेट अप के 1 घंटे और थाली की लोडिंग एक रात incu द्वारा पीछा के साथ कुल,bation कदम और अतिरिक्त ऊष्मायन और धोने के अगले दिन दोहराएँ. जो कुओं में शामिल होंगे जो पुस्तिका कार्यपत्रक के अनुसार lysate बाहर नक्शा. Homogenized ऊतक और कमरे के तापमान पर नमूनों किट lysates पहले गला लें, और फिर बर्फ पर जगह है. किट में कमरे के तापमान के लिए प्रदान की (streptavidin और मोती को छोड़कर) सभी buffers और अभिकर्मकों लाओ. मल्टीप्लेक्स परख के लिए मोती तैयार. कवर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ मिलकर मोती युक्त प्रकाश से बचाने ट्यूबों. 5 सेकंड और बर्फ पर रखने के लिए भंवर ट्यूब. मिलकर मोती 1:50 धोने बफर में पतला. हर अच्छी तरह से अच्छी तरह से 50 प्रतिशत μL की कुल मात्रा के लिए 49 μL धोने बफर में मिलकर मोतियों की एक μL शामिल करना चाहिए. निर्वात तंत्र जांचना. 100 μL प्रति में अच्छी तरह धोने बफर के साथ थाली धो लें. 2-5 सेकंड के भीतर किसी भी अतिरिक्त तरल बंद वैक्यूम और चूषण पर मुड़ें. यदि बफर की पूरी हटाने या उससे अधिक समय 2-5 की तुलना में सेकंड कम लेता है, दबाव वाल्व तदनुसार समायोजित करें. नमूने जोड़ने से पहले थाली के नीचे अच्छी तरह से सूखे. 5 सेकंड के लिए पतला मिलकर मोती भंवर और नामित कुओं से 50 μL जोड़ें. तुरंत वैक्यूम फिल्टर और एक कागज तौलिया के साथ प्लेट के नीचे सूखी. थाली 100 μL प्रति में अच्छी तरह धोने बफर के साथ दो बार धो. प्रत्येक धोने के बाद थाली के नीचे सूखी. भंवर 3 सेकंड के लिए नमूने thawed और नामित कुओं से 50 μL जोड़ने. जगह की थाली और सेते पर 15-18 बजे कमरे के तापमान पर 300 rpm पर मिलाते हुए, प्रकाश से रक्षा के लिए टेप सील. वैक्यूम फिल्टर अतिरिक्त तरल और 100 μL धोने बफर के साथ धोने प्लेट तीन बार. प्रत्येक धोने के बाद थाली के नीचे सूखी. धोने बफर में एंटीबॉडी का पता लगाने 01:25 पतला. हर अच्छी तरह से 1 25 μL धोने बफर की कुल मात्रा में μL एंटीबॉडी का पता लगाने की आवश्यकता है. सील टेप थाली पर प्लेस और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रकाश से बचाने के लिए. 30 सेकंड के लिए हिलाओ, धीरे – धीरे 1100 rpm गति बढ़ाने. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 300 rpm पर मिलाते हुए आगे बढ़ें. वैक्यूम थाली फिल्टर और 100 μL धोने बफर के साथ तीन बार धो लो. प्रत्येक धोने के बाद थाली के नीचे सूखी. जबकि प्रकाश से थाली की रक्षा, पर्याप्त मात्रा के साथ 50 μL प्रति अच्छी तरह से जोड़ने के streptavidin पीई के एक 1:100 कमजोर पड़ने को तैयार. प्रकाश से समाधान को सुरक्षित रखें. भंवर अच्छी तरह से और अच्छी तरह से प्रति 50 μL पतला streptavidin-पीई जोड़ने. के लिए 1100 rpm पर 30 झटकों के साथ सेते सेकंड 300 rpm पर 10 मिनट के द्वारा पीछा किया. वैक्यूम फिल्टर अतिरिक्त बंद बफर. प्लेट अच्छी तरह से प्रति 100 μL resuspension बफर के साथ तीन बार धो लें. प्रत्येक धोने के बाद अच्छी तरह से थाली के नीचे सूखी. हर अच्छी तरह से 125 μL resuspension बफर जोड़ें और 30 सेकंड के लिए 1100 rpm पर हिला. तुरंत ° सी दूर प्रकाश से 4 बजे 24 घंटे के लिए थाली या दुकान को पढें. 5. नक़ल करना और cytokine संकेतन के मॉडुलन पुनः संयोजक साइटोकाइन प्रोटीन (वाहक के साथ) एसडी के परिवर्तन की नकल करने के लिए उपयोग किया जाता है. Lyophilized प्रोटीन (जैसे, TNF-α) 1 वर्ष के लिए -20 ° सी. पर संग्रहीत कर रहे हैं 0.1% गोजातीय सीरम albumin aliquots, के साथ एक शेयर के समाधान के लिए गिराए के बाद तैयार कर रहे हैं -20 ° सी में संग्रहीत 3 महीने के भीतर उपयोग करें जब तक. टुकड़ा संस्कृतियों के लिए कोई जोड़तोड़ कम से कम हर तीसरे दिन ताजा कर रहे हैं. Cytokine संकेतन द्वारा खामोश है: पारंपरिक झरना औषधीय एजेंटों संकेत साइटोकाइन का उपयोग; घुलनशील ligand प्रतिपक्षी के प्रयोग [उदाहरण के लिए, घुलनशील TNF 1 रिसेप्टर (पुनः संयोजक ligands के लिए ऊपर वर्णित)], या जीन मुंह बंद [यानी, छोटे दखल) शाही सेना (siRNA]. Neuronal कोशिकाओं को siRNA की डिलिवरी अक्सर समस्याग्रस्त है. आम लिपिड आधारित अभिकर्मकों आमतौर पर कम अभिकर्मक दक्षता और सेल व्यवहार्यता के नुकसान में परिणाम. इसके बजाय, हम थर्मो वैज्ञानिक Dharmacon Accell siRNAs है, जो एक अभिकर्मक अभिकर्मक के उपयोग के बिना उच्च दक्षता पछाड़ना के लिए अनुमति देते हैं का उपयोग करें. यहाँ हम cyclophilin बी, एक गैर जरूरी प्रोटीन, सभी प्रकार की कोशिकाओं में व्यक्त की पछाड़ना टुकड़ा संस्कृतियों में इस पद्धति के उपयोग की पुष्टि के रूप में दिखाते हैं. डिलिवरी प्रोटोकॉल पक्षपाती कोशिकाओं में उपयोग के लिए निर्माता के निर्देशों से टुकड़ा संस्कृतियों के लिए अनुकूलित किया गया. 1x RNase मुफ्त पानी के साथ 5x siRNA बफर पतला. 1x बफर में 100μM siRNA समाधान तैयार Cyclophilin बी siRNA 5 nmol पर प्रदान की जाती है. एक 100 सुक्ष्ममापी स्टॉक के लिए 1x बफर के 50 μL में Resuspend. Accell वितरण mediu के साथ मिक्स siRNA1μM siRNA के अंतिम एकाग्रता के लिए कर रहा हूँ. Accell 6 अच्छी तरह से एक थाली में प्रसव के माध्यम से 1100 μL 100 सुक्ष्ममापी शेयर siRNA के 11 μL जोड़ें. इनक्यूबेटर में रखें और तापमान सामान्य ऊष्मायन शर्तों के कम से कम 20 मिनट के लिए संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं. प्रसव के मिश्रण युक्त कुओं में एक डाकू BSL-2 और बाँझ तकनीक, स्थानांतरण आवेषण का उपयोग करना. प्रोटीन पछाड़ना के लिए 96 घंटे के लिए प्रसव के मिश्रण के साथ सेते हैं. वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा प्रोटीन पछाड़ना आकलन या immunostaining तेज. पश्चिमी blots, जबकि पछाड़ना दक्षता के लिए एक संभावित पहली पसंद भी कम स्तर प्रतिरक्षा एसडी के गैर हानिकारक घटना के साथ जुड़े संकेत के लिए असंवेदनशील हो सकता है. तदनुसार, हम नकारात्मक चांदी बढ़ाया diaminobenzidine (थपका) immunostaining और कंप्यूटर आधारित densitometry माप (नीचे देखें) के साथ वेस्टर्न ब्लॉट माप का पालन किया है. 6. प्रोटिओमिक पुष्टि Phosphoprotein परिवर्तन के सेल विशिष्टता immunostaining का उपयोग करने के लिए स्थापित है. 6,7 पीएलपी लगानेवाला के साथ 24 बजे के निर्वाचकगण के लिए टुकड़ा संस्कृतियों फिक्स: 10 एमएल 16% paraformaldehyde, 1.096 ग्राम lysine, 0.42 ग्राम सोडियम फॉस्फेट, और 0.17 ग्राम सोडियम periodate, ultrapure पानी (लगानेवाला 6.2 पीएच है) के साथ 80 एमएल की कुल मात्रा से भरा है. 24 बजे के बाद, धीरे आवेषण से एक ठीक है और जब तक अनुभाग के लिए तैयार पीबीएस युक्त सोडियम azide (100 मिलीग्राम / एल) के लिए स्थानांतरण ब्रश के साथ टुकड़ा संस्कृतियों को हटाने. फिर, स्लाइस PBS-20% sucrose में कम से कम 24 बजे सेते हैं, 20 सुक्ष्ममापी वर्गों के लिए पूरे टुकड़ा संस्कृतियों में कटौती करने के लिए, और जेल लेपित स्लाइड्स के लिए माउंट. प्रतिदीप्त immunostaining (जैसे NFκB के लिए) के रूप में ~ 50 rpm पर मिलाने के लिए सभी मिलकर कदम के साथ इस प्रकार पूरा किया है. टुकड़ा संस्कृतियों में 10 मिनट के लिए 3 एमएल पीबीएस तीन बार धोएं. प्लेस स्लाइड्स के साथ Coplin ~ 40 एमएल पीबीएस के साथ धोने के सभी चरणों के लिए जार में 20 सुक्ष्ममापी टुकड़ा संस्कृतियों मुहिम शुरू की. पीबीएस तीन बार, धोने प्रति 10 मिनट में टुकड़ा संस्कृतियों धो लें. टुकड़ा संस्कृतियों पर SFX संकेत बढ़ाने की कुछ बूँदें प्लेस और 30 मिनट के लिए एक नम कक्ष में सेते हैं. 2 बजे के लिए 37 टुकड़ा संस्कृतियों सेते ° सी के साथ खरगोश 1:100 पर विरोधी NFκβ एंटीबॉडी 0.75% में पतला ट्राइटन पीबीएस में X-100. पिपेट स्लाइस पर सीधे एंटीबॉडी समाधान. एंटीबॉडी समाधान से स्लाइसें निकालें और धोने प्रति 10 मिनट के लिए पीबीएस में तीन बार धो लो. विरोधी खरगोश बकरी AlexaFluor 594 एंटीबॉडी में एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइस 1:50 पर 0.75% में सेते ट्राइटन पीबीएस में X-100. 15 मिनट के लिए 10,000 rpm पर 594 एंटीबॉडी AlexaFluor कि समाधान में गठन हो सकता है किसी भी वेग निकालने अपकेंद्रित्र. Pbs, धोने प्रति 10 मिनट में तीन बार धोएं. आसुत जल में डुबकी स्लाइड्स से पीबीएस से किसी भी लवण कुल्ला करने के लिए. साथ Coverslip antifade मध्यम लम्बा और कम से कम 2 घंटे के लिए सूखी, प्रकाश से दूर कवर. पारंपरिक या confocal (छवि 7) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ कल्पना . प्रोटीन siRNA पछाड़ना से उत्पादन में परिवर्तन संवेदनशीलता पारंपरिक थपका बढ़ाने चांदी 16 गहनता और बाद densitometric मात्रा का ठहराव (जैसे, के रूप में cyclophilin B के लिए यहाँ दिखाया) (वीडियो चित्रा 2) के माध्यम से 7 immunostaining द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. Cyclophilin बी के लिए Immunostaining उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग हम हाल ही में विस्तृत, 7 का उपयोग कर के लिए मानक प्रक्रिया इस प्रकार है: 24 घंटे के लिए विरोधी माउस cyclophilin बी (1:100) 4 डिग्री सेल्सियस; हॉर्सरैडिश peroxidase माध्यमिक एंटीबॉडी लेबलिंग (1:100) द्वारा पीछा किया; और थपका दृश्य. च थपका प्रतिक्रियाओं भी डिजिटल densitometric quantification17 की अनुमति बेहोश कर रहे हैं, वे Quinn और Graybiel अनुसार एक विभेदित चांदी प्रक्रिया के साथ तेज किया जा सकता है 16. Rehydrate स्लाइड्स और फिर अच्छी तरह से 10 मिनट के लिए उच्च शुद्धता पानी में x 3 धो. उच्च शुद्धता पानी में एक Coplin जार और 56 डिग्री सेल्सियस तक गर्म में स्लाइड्स प्लेस Ammoniacal चांदी नाइट्रेट समाधान (0.5%) तैयार करें: शेयर अमोनियम क्लोराइड (25-30%) हौसले उच्च शुद्धता पानी के साथ पतला है (1:1). अमोनियम हीड्राकसीड (~ 100 एमएल प्रति 500-600 μL) 0.5% चांदी नाइट्रेट समाधान है जो संक्षेप में बादल छाए रहेंगे और फिर स्पष्ट बंद हो जाएगा करने के लिए सरगर्मी के साथ ड्रॉप द्वारा ड्रॉप जोड़ें. 56 के लिए समाधान गर्म डिग्री सेल्सियस 10-12 मिनट के लिए वर्गों सेते हैं. 15 सेकंड के लिए उच्च शुद्धता पानी (इस और बाद के सभी चरणों Coplin जार का उपयोग कर कमरे के तापमान पर किया जाता है) में स्लाइड्स धो लें. 15 सेकंड के लिए 1% सोडियम thiosulfate (Pentahydrate) में डुबकी स्लाइड्स. डुबकी उच्च शुद्धता पानी में 15 सेकंड के लिए स्लाइड. 0.2% सोने क्लोराइड में 2 मिनट के लिए स्लाइड्स स्वर. 15 सेकंड के लिए उच्च शुद्धता पानी में डुबकी स्लाइड्स. 2 मिनट के लिए 0.5% oxalic एसिड स्लाइड्स बेनकाब. उच्च शुद्धता पानी में 15 सेकंड के लिए स्लाइड्स डुबकी. 5% सोडियम thiosulfate में 5 मिनट के लिए स्लाइड्स को समझो. उच्च शुद्धता पानी, निर्जलीकरण, और coverslip में अच्छी तरह से धो स्लाइड. स्लाइड्स अब कर रहे हैं densitometric मात्रा का ठहराव के लिए तैयार 17 . उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश व्यवस्था सहित सभी उपकरण, इमेजिंग से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए चालू है. पूरे टुकड़ा संस्कृति वर्गों 5-10x पर एक औंधा माइक्रोस्कोप पर imaged हैं. हल्की तीव्रता एक समान स्तर पर (उदाहरण के लिए, ~ 2.6 वी) के लिए सेट कर दिया जाता है और सभी छवि अधिग्रहण के दौरान नहीं बदला है. तटस्थ घनत्व फिल्टर का इस्तेमाल कर रहे हैं के रूप में पूर्ण 1500 ~ एक 12 – बिट (0-4095) पैमाने जहां "0" पूरी तरह से काला है और 4095 पूरी तरह से सफेद है पर प्रकाश तीव्रता प्रेषित छवि को कम करने की जरूरत है. डिजिटल छवियों तो अर्जित कर रहे हैं और सभी (यानी, नकली नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूने) के लिए इलेक्ट्रॉनिक संग्रहीत व्युत्पन्न टुकड़ा संस्कृति वर्गों के बिना स्लाइड के एक क्षेत्र के रूप में एक पृष्ठभूमि छवि सहित. पृष्ठभूमि छवि सभी नकली (और प्रयोगात्मक) छवियों और ब्याज की एक क्षेत्र (AOI) प्रत्येक टुकड़ा संस्कृति के चारों ओर खींचा और प्रकाश पंजीकृत तीव्रता प्रेषित से subtracted है. छवि तीव्रता श्रेणी के सभी प्रयोगों के लिए एक निरंतर श्रृंखला के लिए सेट कर दिया जाता है. स्पष्टता के लिए, परिणामी एक रिश्तेदार घनत्व नियंत्रण स्तर (8 छवि) की तुलना के रूप में व्यक्त किया. 7. प्रतिनिधि परिणाम: चित्रा 1. स्लाइस संस्कृति electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रतिमान रिकॉर्डिंग. Microelectrode पहले CA3 पिरामिड न्यूरॉन परत में रखा जाता है और फिर एक द्विध्रुवी उत्तेजक इलेक्ट्रोड दांतेदार गाइरस (डीजी) में रखा गया है. चित्रा 2. CA3 क्षेत्र क्षमता पैदा की और synaptically अवसाद के प्रसार प्रेरित. (ए) प्रयोगों वर्तमान मानक CA3 क्षेत्र क्षेत्र संभावित और फिर प्रतिक्रियाओं आधा – अधिक से अधिक तीव्रता CA3 क्षेत्र क्षेत्र पैदा की क्षमता को प्रकाश में लाना करने के लिए प्रयोग किया जाता है को अधिकतम करने के लिए जरूरत निर्धारण के साथ शुरू करते हैं. इस तैयारी के बीच पैदा synaptic प्रतिक्रियाओं का सामान्य दस्तावेजों. यदि एक टुकड़ा क्षेत्र उत्तेजक पोस्ट synaptic क्षमता कम से कम 3 एम वी नहीं कर रहे हैं, स्लाइस खारिज कर दिया. (बी) अगला प्रसार अवसाद ट्रिगर करने के लिए दहलीज पार synaptically पैदा है (ठीक है, धीमी गति से प्रतिक्रियाएं) निर्धारित जबकि एक ही समय क्षेत्र क्षमता में (बाएं , तेजी से प्रतिक्रियाएं) दस्तावेज है कि तैयारी काफी स्वस्थ करने के लिए 10 हर्ट्ज उत्तेजना (जैसे, तेजी से संभावित रिकॉर्ड में ऊर्ध्वाधर विचलन के amplitudes समान हैं) का पालन कर रहे हैं उपयोग किया जाता है. चित्रा 3. Microglial कम synaptic गतिविधि. साक्ष्य के साथ जुड़े गति से पता चलता है कि microglial शाखाओं का विस्तार और वृद्धि की synaptic गतिविधि के साथ वापस लेना है, लेकिन synaptic गतिविधि के जवाब में इन कोशिकाओं की लंबी दूरी की गति रिहाई मस्तिष्क में नहीं वर्णित किया गया है. हमारे microglia शो है कि इन कोशिकाओं के एक अंश सामान्य परिस्थितियों में लंबी दूरी की चाल के फ्लोरोसेंट isolectin B4 लेबलिंग का उपयोग कर परिणाम. इसके अलावा, इन यात्रा microglia की संख्या काफी बढ़ जाती है जब synaptic गतिविधि संस्कृति tetrodotoxin करने के लिए जोखिम से समाप्त कर दिया है के रूप में साथ छवि में दिखाया गया है. लाल लाइनों निशान पथ microglia द्वारा नीले तीर कुछ अनुकरणीय microglia के मूल अंकन के साथ 6 बजे की अवधि में कूच. अंशांकन बार, 50 सुक्ष्ममापी. चित्रा 4. पीसीआर स्क्रीनिंग गतिविधियों. Qiagen अकेले किट के उपयोग से hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों में से एक शाही सेना उपज में (बी), (ए) हम शाही सेना के अलगाव के लिए Qiagen किट के साथ साथ TRIzol के बाद से, हमारे हाथ में काफी अधिक समय में इस परिणाम (टी परीक्षण पी 0.001 <) का उपयोग इसके अलावा, हम समय – समय पर पुष्टि करते हैं कि हमारे आरएनए निष्कर्षण प्रक्रियाओं उच्च गुणवत्ता बरकरार शाही सेना के उत्पादन के रूप में एक जेल है कि तेज शाही सेना के बैंड से पता चलता है के माध्यम से निर्धारित (सी) हम NormFinder सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए एक का सबसे अच्छा स्थिरता मूल्य के साथ एक संदर्भ जीन का चयन.. उदाहरण के लिए, टुकड़ा संस्कृतियों उजागरतीन संदर्भ जीन (Rpl13a, β-actin, 18s) के लिए lipopolyssacharide (100 एनजी / एमएल 2 बजे के लिए) के लिए विश्लेषण किया गया. सीटी मूल्यों के लिए एक स्थिरता मूल्य की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है. हमारे यहाँ डेटा [और कहा कि प्रसार अवसाद (नहीं दिखाया डेटा) का उपयोग कर अन्य प्रयोगों के लिए] बताते हैं कि Rpl13a एक इष्टतम संदर्भ जीन है. (डी) हम एक संवेदनशील और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य साधन के रूप में "ΔΔCt" विधि का उपयोग करने के लिए गुना परिवर्तन प्रयोगात्मक समूहों और नकली नियंत्रण के बीच शाही सेना मतभेदों का पता लगाने. चित्रा 5. पीसीआर प्रतिक्रिया चेक. (ए) हम पीसीआर प्रतिक्रियाओं की गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए साधन के रूप में प्राइमरों के लिए कमजोर पड़ने वक्र amplifications उपाय. उदाहरण के लिए, इष्टतम amplifications सीटी थ्रेसहोल्ड में एक समान वृद्धि (1-5) दिखाने के विपरीत (बी), amplifications गरीब प्राइमरों (1-5) के साथ एक समान नहीं हैं. (सी) इसके अलावा, हम पर एक पिघल वक्र प्रदर्शन पीसीआर assays के निष्कर्ष पुष्टि करते हैं कि वांछित amplicons (यानी, एक एकल चोटी वक्र) पता चला रहे हैं, जो किसी भी प्राइमर dimers सहित डबल असहाय डीएनए के अभाव का संकेत है, डीएनए और misannealed पीसीआर उत्पाद (जो कई शिखर घटता के रूप में प्रकट होता है) contaminating. चित्रा 6. नैनो पूर्व – प्रवर्धन hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों में IFN-λ का पता लगाने की अनुमति देता है केवल बाद से ~ 50 टी कोशिकाओं एक टुकड़ा संस्कृति (~ 55,000-90,000 कुल कोशिकाओं के बाहर) में पाए जाते हैं, हम आरटी नैनो 2 preamp सीडीएनए संश्लेषण किट के रूप में इस्तेमाल किया. संभावित अल्ट्रा कम IFN-λ के स्तर की अभिव्यक्ति का पता लगाने का मतलब है. सीडीएनए preamplification इसका मतलब यह है संवेदनशीलता में वृद्धि 12 गुना के स्तर आरएनए प्रदान की है. ऊपर दिखाए गए परिणामों preamplification की क्षमता का पता लगाने संवेदनशीलता को बढ़ाने के वर्णन. संदर्भ जीन Rpl13a के लिए सीटी दहलीज प्रारंभिक प्रवर्धन के साथ 20.5 था और इस preamplification किट, एक 12 गुना सीडीएनए का पीसीआर प्रवर्धन के 12 चक्रों के लिए इसी वृद्धि के उपयोग के साथ 14.1 के लिए बढ़ा दिया गया था. समानांतर में, IFN-λ detectable (0.0) नहीं था लेकिन preamplification के साथ पता लगाने रेंज (29.0) के भीतर अच्छी तरह से किया गया था. 7 चित्रा. जन्मजात साइटोकाइन मार्ग phosphoprotein phosphorylation परिवर्तन. (ए) जन्मजात साइटोकाइन मार्ग phosphoprotein phosphorylation 24 बजे पर TNF-α अनुकरणीय प्रभाव (यानी, neuroprotection) hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों में excitotoxic चोट के बाद pretreatment. परिणाम दिखाने CA1 (NMDA) एन मिथाइल-D-aspartate NMDA अकेले (यानी, प्रयोगात्मक बनाम नकली) को उजागर उन की तुलना करने के लिए जोखिम से पहले 3 दिनों के लिए 100 एनजी / एमएल TNF-α साथ pretreated स्लाइस के बीच के क्षेत्र में परिवर्तन के रूप में व्यक्त प्रतिशत. सूचना है कि TNF-α JNK और एटीएफ-2 में एक निरंतर phosphorylation वृद्धि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से NFκB में एक क्षणिक वृद्धि प्रेरित (बी) NFκB सक्रियण (यानी, नाभिक में phosphorylated NFκB के उपस्थिति) के स्थानिक वितरण immunostaining से पता चला है. ( लाल). YoYo दाग नाभिक हरे रंग की एक टुकड़ा संस्कृति [जैसे astrocytes में (तीर सिर)] अनुभाग में. पिरामिड न्यूरॉन्स, जो अन्यथा भी हरी प्रकट होता बजाय phosphorylated NFκB (लाल) के साथ सहवर्ती अंकन की वजह से पीले हैं. अंशांकन बार, 25 सुक्ष्ममापी 8 चित्रा. SiRNA दक्षता के प्रोटिओमिक पुष्टि peroxidase diaminobenzidine cyclophilin बी के लिए आधारित immunostaining विभेदित चांदी गहनता से पता चलता है कि siRNA काफी (0.001 <पी, एनोवा होल्म – Sidak विधि) 200, 500 के आवेदन के बाद 3 दिन वैश्विक hippocampal टुकड़ा cyclophilin बी अभिव्यक्ति को कम कर सकते हैं या 1,000 एनएम siRNA.
Discussion
एसडी मस्तिष्क के एक कंपकंपी गड़बड़ी विशेषताओं जिसका सभी प्रजातियों और मस्तिष्क क्षेत्रों में अत्यधिक संरक्षित तिथि करने के लिए जांच है. एसडी सामान्यतः neocortex में अध्ययन किया है. फिर भी, इस संरचना के तंत्रिका सर्किट जटिलताओं (हिप्पोकैम्पस के लिए तुलना में), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से neocortex मौन प्रतिरक्षा कार्यों के साथ लंबी अवधि के लिए इन विट्रो में जिंदा रखने के अक्षमता, इन विट्रो तैयारी में दीर्घकालिक परिणामों को परिभाषित करने के लिए यह कम एक के रूप में उपयोगी बनाने के एसडी संवेदनशीलता की. इसके विपरीत, हिप्पोकैम्पस न केवल मस्तिष्क संरचना है कि सबसे एसडी के प्रति संवेदनशील है, यह भी एक अधिक सरल तंत्रिका सर्किट संरचना और समारोह, जो अच्छी तरह से neuroimmune मतलब है जिसके द्वारा तंत्रिका गतिविधि एसडी संवेदनशीलता न्यूनाधिक कर सकते हैं परिभाषित करने के लिए अनुकूल है के साथ एक archicortical संरचना है .
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम मस्तिष्क संबंधी विकार के राष्ट्रीय संस्थान और स्ट्रोक (एन एस 19,108), बाल स्वास्थ्य और रोग के राष्ट्रीय संस्थान (PO1 HD09402), माइग्रेन रिसर्च फाउंडेशन और व्हाइट फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. सुश्री मेरिको पी. Kraig तैयारी और संस्कृति प्रणालियों के रखरखाव में सहायता की.
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number |
|---|---|---|
| Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010 |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Sigma | E2888 |
| Horse Serum | Invitrogen | 26050-088 |
| Glutamax | Invitrogen | 35050 |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-064 |
| Fungizone | Invitrogen | 15295 |
| D-glucose | Sigma | G8769 |
Table 1. Culture Preparation and Maintenance: Horse Serum Medium
| [header] | |||
|---|---|---|---|
| Neurobasal | Invitrogen | 21103 | |
| Gem-21 Neuroplex | Gemini Bioproducts | 400-160-010 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-064 | |
| D-glucose | Sigma | G8769 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15295 | |
| Sodium chloride | Sigma | S6546 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M1028 | |
| Calcium chloride | Sigma | 21115 |
Table 2. Culture Preparation and Maintenance: Serum-free Medium
| [header] | |||
|---|---|---|---|
| Millicell-CM tissue culture inserts (30 mm) | Thermo Fisher | PICM0-3050 | |
| 6-well Falcon culture dishes | Thermo Fisher | 08-772-1B | |
| Sytox Green | Invitrogen | S7020 |
Table 3. Materials fabrication: Ground Electrodes
| [header] | |||
|---|---|---|---|
| Glass capillary tubes | A-M Systems, Inc. | 2mm x 1.16mm, 4 inches | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360 | |
| EDTA | Sigma | 5134 | |
| Tubing | Masterflex | 95809-34 | |
| 1.5 mL centrifuge tube rack | Fisher Scientific | ||
| Silver wire | Medwire | AG15X | |
| Hemostat | Fine Scientific Tools | 13018-14 | |
| Emery board | Walgreens | ||
| Scintillation vial | Fisher Scientific | ||
| Flexible adhesive sealant | Amazing Goop | ||
| Bleach | Clorox |
Table 4. Materials fabrication: Ground Electrodes
| [header] | |||
|---|---|---|---|
| Borosilicate filament | Sutter Instruments | BF150-86-10 | 1.5 x 0.86 mm |
| Microelectrode puller | Narashige | PE-2 | |
| Eye piece optical micrometer | Zeiss | ||
| Stage optical micrometer | Zeiss | ||
| Compound Microscope | Zeiss | ||
| Microscope slides | Surgipath | 00210 | |
| 1-Dimensional microelectrode manipulator | Narashige | MO-10 | |
| 3-dimensional microelectrode manipulator | Narashige | MM-3 | |
| Adhesive putty | Scotch | ||
| 100 mm Nalgene containers | Fisher Scientific |
Table 5. Materials fabrication: Recording Electrodes
| [header] | |||
|---|---|---|---|
| Teflon-coated platinum iridium wire | A-M Systems | 7780 | 125 μm bare, 200 μm coated |
| Forceps | Thermo Fisher | 13-812-38 | |
| Hemostat | Fine Scientific Tools | 13018-14 | |
| 30 gauge wire | Tensolite | ||
| Soldering iron | Cooper Tools | UTC 100 | |
| Solder | Bernzomatic | Resin core, lead free, silver bearing | |
| Concentrated HCl | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | |
| Water-resistant epoxy | JB Weld | ||
| Banana jacks | Newark Electronics |
Table 6. Materials fabrication: Stimulating Electrodes
| [header] | |||
|---|---|---|---|
| Falcon 35 mm culture dish | Becton Dickinson Labware | ||
| Glass filament tubes | Sutter Instrument Co. | BF100-58-10 | 1.0 mm, 12 mm long |
| Cotton squares | Walgreens | ||
| Forceps | Thermo Fisher | 13-812-38 | |
| Tubing | Masterflex | 95809-34 | |
| Poly vinyl chloride film | Fisher Scientific | 01810 | 18 inches x 1000 feet |
| #9 single edge razor blade | Smith |
Table 7. Materials fabrication: Recording Dishes
| [header] | |||
|---|---|---|---|
| Recording chamber | Medical Systems Corp. | PDMI-2 | Recording chamber |
| Bipolar temperature control | Medical Systems Corp. | TC-202 | |
| Combination pH electrode | Microelectrodes Inc. | MI-413 | |
| pH meter | Beckman | 250 | Battery operated |
| Mini Type-T thermocouples | Physiotemp | IT series | |
| DigiSense thermometer | Cole-Palmer | 8528-10 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH278 | |
| Gibraltor table | Burleigh | ||
| Inverted microscope | Leica | DMIRE2 | |
| Anti-vibration Table | Technical Manufacturer’s Corp | 63-541 | |
| Cautery tool | Gemini | Battery operated | |
| Microelectrode micromanipulators | Narashige | WR60 | Left and right |
| Stabilized power supply | MGE UPS systems | Ellipse 1200 | +/- 5 volts (120 total) |
| Axoprobe amplifier system | Axon instruments | 1-A | |
| Active filter | Frequency Devices | Model 900 | |
| Axoscope Digidata | Axoscope | 1322-A | |
| Axoscope software | Axoscope | v. 9 | |
| Computer systems | Dell | Precision T5400 | |
| Origin8 | OriginLab Corp | v. 8.1 | |
| Stimulator isolation unit | Bak Electronics, Inc. | BSI-II | |
| 1/2 inch position magnets | Dexter | PMO90-3 | |
| 3 inch position magnets | Dexter | PMC-800T | |
| Multiple X-Blocks | Narishige | X-12 | For positioning ball joints |
| Valves | Hamilton | HVD-3 | For medium delivery |
| Syringe pump | Razel | A99 | |
| Digital oscilloscope | Agilant technologies | ||
| Digital camera system | Quant EM | 512-SC | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | v. 7.5.04 | |
| Microscope objective focus with Pi foc | Physik Instrumente | E-662.LR | |
| Smart shutter | Lambda SC | ||
| Dual wavelength fluorescent microscopy | Applied Scientific Instruments | Polychrome II | |
| Peristaltic pumps | Masterflex | 77120-62 | |
| Aspirator | Harvard Apparatus | PDMI component |
Table 8. Electrophysiological Setup
| [header] | |||
|---|---|---|---|
| 1 M Magnesium Chloride | Sigma | 057K8620 | |
| 1 M Manganese Chloride | Sigma | 018K6107 | |
| 1 M Calcium Chloride | Sigma | GA10984 | |
| AlexaFluor594-tagged Isolectin-IB4 | Invitrogen | I21413 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 21103 | |
| Polyvinyl chloride film | Fisher Scientific | 01810 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | v. 7.5.04 | |
| Inverted microscope | Leica | DMIRE2 | |
| Camera | QuantEM | 512SC | |
| UV light | Kubler | CODIX | |
| Bipolar Temperature Controller | Medical Systems Corp | TC-202 | |
| Smart shutter | Lambda SC | ||
| Sytox Green | Invitrogen | S7020 | |
| Falcon 35 mm culture dishes | Becton Dickinson Labware | ||
| Glass filament tubes | Sutter Instrument Co. | BF100-58-10 | 1.0 mm, 12 mm long |
| Tubing | Masterflex | 95809-34 | |
| Recording chamber | Medical Systems Corp. | PDMI-2 | Recording chamber |
| Bipolar temperature control | Medical Systems Corp. | TC-202 | |
| Combination pH electrode | Microelectrodes Inc. | MI-413 | |
| Gibraltor table | Burleigh | ||
| Anti-vibration Table | Technical Manufacturer’s Corp | 63-541 |
Table 9. Vital Imaging in Hippocampal Slice Cultures
| [header] | |||
|---|---|---|---|
| RNAlater | Ambion | AM7021 | |
| RNase/DNase-free 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Diamond knife | Fine science tools | 10100-00 | |
| Fine-tip paint brush | Ted Pella | 11806 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5451C | |
| Vortex-genie | VWR | G-560 |
Table 10. PCR Preparation: Slice Culture Harvest
| [header] | |||
|---|---|---|---|
| Chloroform | Sigma | C-2432 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5451C | in cold room |
| Ethanol, 200 proof for molecular biology | Sigma | E7023 | |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 |
Table 11. PCR Preparation: RNA Extraction
| [header] | |||
|---|---|---|---|
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher | ND-2000 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid | Sigma | M-1254 | |
| ssRNA ladder | NEB | N032S | |
| Sodium acetate | Sigma | S-9513 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide solution | Bio-Rad | 161-0433 | |
| OWL easycast horizontal mini-gel systems | Thermo Fisher | B1 | |
| Electrophoresis power source | Bio-Rad | PowerPac HC | |
| Ultrapure Agarose | GibcoBRL | 15510-019 | |
| Microwave | Samsung | SJ0390W | |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 7000 |
Table 12. PCR Preparation: RNA Quantification
| [header] | |||
|---|---|---|---|
| iCycler thermocycler | Bio-Rad | iCycler Optical Module | |
| iCycler system software | Bio-Rad | v. 3.1 | |
| iCycler iQ PCR plates, 96 well | Bio-Rad | 2239441 | |
| Flat cap strips – optically clear. 8-cap strip | Bio-Rad | TCS0803 | |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 170-8880 | |
| Ultrapure Agarose | GibcoBRL | 15510-019 | |
| 10x TAE buffer | GibcoBRL | 15558-026 | |
| Microwave | Samsung | SJ0390W | |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 7000 | |
| Ethidium Bromide solution | Bio-Rad | 161-0433 | |
| OWL easycast horizontal mini-gel systems | Thermo Fisher | B1 | |
| Electrophoresis power source | Bio-Rad | PowerPac HC | |
| Name | sequence | ||
| TNF-α F | 5′ – ACC ACG CTC TTC TGT CTA CTG A- 3′ | ||
| TNF-α R | 5′ – CTG ATG AGA GGG AGC CCA TTT G- 3′ | ||
| Rpl13a F | 5′ – TTG CTT ACC TGG GGC GTC T- 3′ | ||
| Rpl13a R | 5′ – CTT TTT CCT TCC GTT TCT CCT C- 3′ | ||
Table 13. PCR Activities: qPCR primer optimization and pre-screening
| [header] | |||
|---|---|---|---|
| RT2 Profiler PCR array | SABiosciences | PARN-021 | |
| RT2 Nano preAMP cDNA synthesis kit | SABiosciences | C-06 | |
| RT2 Nano preAMP cDNA synthesis primer mix | SABiosciences | PBR-3021 | |
| RT2 SYBR Green/ fluorescein qPCR master mix | SABiosciences | PA-011 | |
| RT2 qPCR Primer Assay for Rat IFN-λ | SABiosciences | PPR45050C | |
| Multichannel pipettor | Corning | ||
| 25 mL Bio-pure reservoir with divider | Diversified biotech | REBP-2000 | |
| iCycler thermocycler | Bio-Rad | iCycler Optical Module | |
| iCycler system software | Bio-Rad | v. 3.1 |
Table 14. qPCR array plates and low level signaling
| [header] | |||
|---|---|---|---|
| Centrifuge | Fisher Scientific | Micro 7 | |
| Cell lysis kit | Bio-Rad | 171-304011 | |
| BSA protein stock | Bio-Rad | 500-0007 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Sealing tape | Bio-Rad | 2239444 | |
| 96-well plate reader | Perkin Elmer | 1420-multilabel counter | |
| Phospho 6-plex Assay Lysates | Bio-Rad | X7000000502 | |
| Phospho 6-plex coupled beads | Bio-Rad | X700000050 |
Table 15. Multiplex Phosphoprotein Assay
| [header] | |||
|---|---|---|---|
| Accell 5x siRNA Buffer | Thermo Scientific | B-002000-UB-100 | |
| Accell siRNA Delivery Medium | Thermo Scientific | B-005000-100 | |
| Accell Cyclophilin Pool-Rat | Thermo Scientific | D-001920-30-05 |
Table 16. siRNA
| [header] | |||
|---|---|---|---|
| 16% paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Lysine | Sigma | L-6001 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | S374-1 | |
| Sodium periodate | Sigma | S-1878 | |
| Sodium azide | Sigma | S-2002 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| Tissue-Tek | Ted Pella Inc. | 27050 | |
| Fine-tip paint brush | Ted Pella | 11806 | |
| Tissue slides | Surgipath | 00210 | |
| Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
| Hydrogen peroxide (30%) | Sigma | H1009 | |
| SFX signal enhancer | Invitrogen | A31631 | |
| Goat serum | Colorado Serum Company | CS 0920 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Anti-NFκβ antibody | Santa Cruz | SC-109 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | |
| Yo-yo nuclear counterstain | Invitrogen | Y-3601 | |
| ProLong antifade | Invitrogen | P7481 |
Table 17. Proteomic Confirmation Via Immunohistochemistry
| [header] | |||
|---|---|---|---|
| Anti-cyclophilin B | R&D Systems | MAB5410 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| Water bath | Pharmacia Biotech | 56-1165-33 | Gebrüder HAAKE GmbH |
| Ammonium hydroxide | J.T.Baker | 9721-03 | |
| Silver nitrate | Sigma | S-0139 | |
| Sodium thiosulfate (pentahydrate) | J.T.Baker | 3949-01 | &nsp; |
| 0.2% gold chloride | Sigma | G-4022 | |
| Oxalic acid | Sigma | O-0376 | |
| CoolSnap fx CCD camera | Photmetrics | ||
| MetaMorph software | Molecular Devices | v. 7.5.04 | |
| Inverted microscope | Leica | DM IRBE | |
| Neutral density filters | Chroma | 0.5-3.0 optical density unit range |
Table 18. Proteomic Confirmation Via Silver Enhanced Immunohistochemistry
Referências
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- Kunkler, P. E., Hulse, R. E., Schmitt, M. W., Nicholson, C., Kraig, R. P. Optical current source density analysis in hippocampal organotypic culture shows that spreading depression occurs with uniquely reversing currents. J Neurosci. 25 (15), 3952-3961 (2005).
- Hulse, R. E., Swenson, W. G., Kunkler, P. E., White, D. M., Kraig, R. P. Monomeric IgG is neuroprotective via enhancing microglial recycling endocytosis and TNF-αlpha. J Neurosci. 28 (47), 12199-12211 (2008).
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Citar este artigo
Pusic, A. D., Grinberg, Y. Y., Mitchell, H. M., Kraig, R. P. Modeling Neural Immune Signaling of Episodic and Chronic Migraine Using Spreading Depression In Vitro. J. Vis. Exp. (52), e2910, doi:10.3791/2910 (2011).