の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

精子との融合後、接合子は、動的な一連のイベントを受ける。これらのイベントは、急速に発展胚に比較的静的な細胞から卵​​母細胞を変換する。多くの生物で、細胞質の再編成は、胚の極性を確立し、卵の活性化にとって重要です。 C.線虫の胚は卵活性化および胚発生のこれらの初期の事象を観察するための素晴らしい機会を提供します。受精後に比較的急速に胚は透明であり、初期の発達のイベントが発生します。C.は虫の研究者が開発の初期段階に関与する蛍光標識タンパク質を発現する多くの有用なトランスジェニック系統を生成している。 RNAiまたは変異体と一緒にこれらの菌株を使用すると、多細胞生物（5、6、7、8）の開発の根底にある分子経路を解剖するための強力なシステムを提供します。このビデオの記事では、C言語の初期胚発生時にイベントを記録するために、これらのツールやテクニックを使用する実用的なアプローチを提示エレガンス。

成熟したC.虫の卵母細胞は、私は、減数分裂前期で逮捕され、成人の雌雄同体の貯精嚢に受精されています。受精後、卵母細胞が減数分裂IとIIの残りの部分を進行する。これらの段階は、蛍光標識ヒストンH2B（5）を用いて観察することができます。母体の減数分裂の完了時に、精子のDNAが凝縮されたままです（図1参照）。減数分裂の終了後、母親と父親のDNAが脱凝縮した二前核の形になります。母親の前核は父系の前核に向かって移行し、彼らは、胚の中央付近に合流する。有糸分裂は、すぐに前核の会議の後に陥ります。これらのイベントのすべては、時間未満で起こる。従って、この一連のイベントのタイムラプス顕微鏡を容易に行うことができます。この手法を実行すると、共焦点顕微鏡にアクセスするために加えて、線虫の培養で特定の施設だけでなく、基本的な顕微鏡のスキルが必要です。

ここに示す例では、トランスジェニックC.を利用：ユビキチンとmCherry：：：H2Bつの蛍光タンパク質、GFPを発現する線虫株 。共焦点レーザ走査型顕微鏡は、これらの2つのタンパク質の動的な局在を観察するために使用されます。さらに、我々は蛍光標識Lysotrackerの注入は受精後の胚におけるリソソームの運命を追跡するために使うことができることを示している。ラベルの付いたトラッカーの注入は、またミトコンドリアや地元のカルシウム濃度の可視化（9）のために行うことができます。理論的には、注入プロトコルは、胚の蛍光標識分子の任意のタイプを表示するために使用することができる。これは、いくつかのケースで標識した小分子、タンパク質、脂質、などが含まれる可能性がある、それはワームが取り込みなどMitoTrackerにより（10）などのいくつかの染料を容易に意志のように実際にラベルが付いたトラッカーを注入する必要はありません。しかし、我々は、浸漬とlysotrackerの注入の両方を試して、胚における可視化のための注射の方がはるかに良い結果を発見した。

技術的な考慮事項：

この手順で示した技術的な課題は、マイクロインジェクション法だけでな​​く、イメージングごく初期の胚の難しさなどがあります。 microinjectionsについては、アガロースインジェクションパッドの厚さは、成功した注射のための非常に重要です。パッドが厚すぎる場合、ワームはdessicateとすぐに死んでしまう。パッドが薄すぎると、ワームは、注入プロセス中にパッドに固執しません。

初期胚は、温度やバッファ条件などの環境条件に敏感であることができる。野生型の胚は精子のDNAと減数分裂II（4）完成の分程度で前核移行の脱凝縮を開始する必要があります。 20分以内には、まず細胞質分裂が開始する必要があります。胚は非常に高いレーザー強度にさらされているか、実装時の過熱または粉砕されている場合、このプロセスが中断されることがあります。このような胚は、開発を逮捕されます。この問題が発生した場合、実験は減少し、レーザパワーや厚いアガロースパッドで繰り返される必要があります。

C. elegansの胚は、すぐに受精後までは、卵の殻を分泌しない。受精と卵の殻の分泌との間の短い時間の間に、胚は母親（11）の外で実行可能ではありません。いくつかのラボでは子宮内でイメージング胚（5、12）で、この課題を避けている。 子宮内イメージングでは、そのような中、または単に受精後に発生するイベントをキャプチャする機能など、特定の利点を提供しています。しかし、この手法は、深部組織のイメージングを可能にする顕微鏡システムを使用する必要があります。このような二光子や多光子などのシステムは、特にこの（13、14）に適しています。従来のレーザースキャンまたは回転するディスク共焦点顕微鏡を使用する場合、最良の画像は、HAその胚から得られるここで説明するようにVE成虫から切り取られて。

イメージングシステムの考慮事項：

使用される共焦点イメージングシステムの種類は、ユーザーのニーズに依存します。保管したいが、可能な限り最高の解像度で画像を取得する場合、一般的に、レーザースキャニングシステムが推奨されています。一方、回転するディスクシステムは、より良い画像取得と画像処理、高度に動的なプロセスに適している比較的急速であり、退色/光毒性が低減されます。

特定の画像処理パラメータは、実験計画や雇用の共焦点イメージングシステムに応じて異なります。多次元イメージングでは、一つには、収集対象となるチャネル、焦点面、および時間点の数を考慮する必要があります。退色や光毒性の制限の影響により、画像の有限の数は、任意の実験で取得することができます。あなたが取得するチャンネル数を増やすことを選択した場合このように、、、おそらく焦点面および/または時間のポイントとその逆の数を減らす必要があります。取得できる画像の総数は、撮像される蛍光体の強度だけでなく、使用されている共焦点顕微鏡の感度に影響されるようになります。より強い蛍光体と、より敏感な楽器は、短い露光時間を必要とするため、少ない光退色や光毒性を生成します。

多数またはイメージングシステムが利用可能です。私たちは自分の研究室で使用されているシステムに関する詳細が得られます。ディスク共焦点顕微鏡を回転させて画像のワームの胚では、プランアポ目的をNA 60X/1.4を搭載したニコンTE2000U倒立顕微鏡を使用してください。顕微鏡は、横河電機CSU10回転するディスクユニット、浜松C9100 – 13 EM CCDカメラ、および405、491、561および655 nmでの出力を持つ4つの固体レーザを含むスペクトル応用研究LMM5レーザーマージモジュールに接続されています。このシステムを使用して我々は、1つまたは2つのチャンネル、六から一二焦点面、および25から50タイムポイントを（30〜60秒間隔で）キャプチャすることができます。典型的な露光時間は100〜200ミリ秒です。

レーザー走査型共焦点顕微鏡とイメージング胚を実現するには、2チャネルと4つの固体レーザ（405、488、555、と635 nm）を装備したツァイスLSM700を使用してください。このシステムは、胚のイメージングに使用計画 – アポ63X/1.4NAの目的でツァイスAxioはオブザーバー倒立顕微鏡に接続されています。システムはまた、限られた画像処理および分析を提供する画像取得用ツァイスZENソフトウェアを使用しています。 two蛍光色素とするときには、イメージング、我々は通常、1から5の焦点面に（〜0.5μm程度離れて）収集し、Zスタックを15秒ごとに収集する。著しい退色が発生するまでのコレクションは継続されています。最終的なタイムラプスビデオを生成するには、Zスタック画像はZENソフトウェアの最大投影ツールを使用して統合されています。動画はaviファイルなどのソフトウェアからエクスポートされます。