Zebrafish의 Pronephros의 레이저 절제는 신장 상피 조직이 재생된를 공부
Summary
인간의 급성 신장 상해 (아키)는 신장 nephrons을 구성하는 상피 세포 손상으로 인한 일반적인 임상 문제, 그리고 아키는 50~70% 1 높은 사망률 속도와 연결되어 있습니다. 이 현상을 안내하는 메커니즘과 한계가 제대로 이해 남아 있지만 상피 세포의 파괴에 따라 nephrons은 재생에 제한 기능이 있습니다. 이 비디오를 문서에서, 우리는 타겟 레이저 zebrafish 배아 신장의 신장 nephron 세포의 박리 또는 pronephros위한 기술을 설명합니다. 새로운 방법은 아키의 nephrotoxicity 유도된 모델을 보완하고 신장 nephron의 상피 조직이 재생된과 관련된 세포 및 분자 변경의 고해상도 이해하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
급성 신장 상해 (아키)는 신장 장애 1 culminates 시간 또는 일 기간 동안 신장 기능의 저하에서 높은 사망률 가격이 특징입니다. 아키는 국소 빈혈, 마약 기반의 독성, 또는 폐쇄 상해 1을 포함한 여러 요인에 의해 발생할 수 있습니다. 유체 및 전해질 항상성을 유지하는 무능력이 발생합니다. 아키가 수십 년간 관찰되어 있지만, 효과적인 임상 치료법이 개발되지 못하고있다. Intriguingly, 아키와 함께 환자는 시간에만 rudimentally 1,2의 특징이되어 버린 불가 사 의한 현상을 통해 신장 기능을 복구합니다. 아키의 포유 동물 모델을 사용하는 연구는 허혈성 또는 콩팥 세포 독소 – 부상 신장이 nephron tubules 1,2, 상피 세포 유형 3 전문 영역의 시리즈 (세그먼트)로 구성되어있는 신장의 기능 단위로 상피 세포의 죽음을 경험하는 것으로 나타났습니다 . nephrons 내에 상피 세포의 죽음은 근위 가느다란 관 세포에서 최고입니다. 세포 파괴가 dedifferentiation, 증식, 그리고 완전히 1,2 nephron를 생성 할 수 상피 세포, 주변의 마이 그 레이션을 따라 제시 증거가있다. 그러나, 부상 신장을 재생하기 위해 인간 사이에 능력의 다양한 변화에 대한 이유로 이러한 이벤트를 변조 신호에 이르기까지 신장 상피 중생의 메커니즘에 대해 많은 의문이 있습니다.
애벌레의 zebrafish는 pronephric 신장이 4,5 포유류를 포함한 높은 척추 동물과 보존 아르 nephrons 구성되어 있습니다 같은 신장 상피 재생을 연구하는 좋은 모델을 제공합니다. zebrafish 애벌레의 nephrons 때문에 젊은 zebrafish 6 상대적인 투명성의 형광 기법과 시각 수 있습니다. 신장이 동물 이내 internalized 구조적으로 복잡한 시스템이기 때문에 이것은 nephrons가 액세스할 포유 동물 모델에 대조적으로 이미지 세포와 실시간으로 분자 변화하는 독특한 기회를 제공합니다. 최근 연구 아키와 후속 신장 실패의 연구에 대한 독성 원인이되는 에이전트로 aminoglycoside의 gentamicin을 사용한 : gentamicin 및 기타 항생제는 인간 아키를 일으키는 것으로 표시되고 있고, 연구자들은 zebrafish 7 신장 손상을 유도하는이 에이전트를 사용하는 방법을 공식화했습니다 8. 그러나, zebrafish 애벌레의 aminoglycoside의 독성의 영향이 재앙과 치명적인 있으며, 시간이 지남에 따라 상피 재생과 기능을 공부하면 어려움을 선물하는. 우리의 방법은 zebrafish에있는 상피 부상 연구를위한 새로운 도구로 타겟 세포 절제의 사용을 보여줍니다. 레이저 박리는 연구자들에게 세포의 제한된 인구의 세포 죽음을 유도하는 기능을 제공합니다. 세포의 다양한 영역은 형태학의 위치, 기능, 또는 특정 세포 표현형 표현에 따라 타겟팅할 수 있습니다. 따라서, 레이저 절제는 연구자가 연구 수의 특이성을 증가되며, 신장 상피 중생의 메커니즘에 대해 설명해 주실 수있는 강력하고 새로운 접근하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 광범위하게 관심의 상황의 수가 부상과 재생을 연구하기 위해 zebrafish 배아에있는 다른 장기의 세포 인구를 대상으로 적용할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
zebrafish는 과학의 여러 측면에 걸쳐 널리 사용되는 모델 유기체이며, 응용 프로그램 중 6 성장하고 있습니다. 아키 같은 신장 질환의 연구에 zebrafish 모델 시스템의 고용은 중요한 관찰을 주도하고 신장 부상 7,8을 연구하는 좋은 모델이 될 것입니다. 합성되어 게놈과 장소에서 많은 분자 프로토콜로, 그것은 유전자 변형 모델, 유전자 최저 및 misexpression 연구를 활용하여 정교한 zebrafish 연구를 수행하는 점점 쉽게되었다. zebrafish는 큰 세대 크기와 잘 정의된 발달 단계와 짧은 라이프 사이클을하고 있습니다. 또한, zebrafish 배아와 애벌레 단계가 유기체의 절개없이 이미징 연구 가능하게, 대부분 투명하고 있습니다. 배아와 애벌레 단계를 통해, zebrafish이 발달 timepoints 중에 눈에 띄는 남아이 nephrons의 구성 pronephric 신장 있습니다. Zebrafish pronephric의 nephrons은 4,5 급성 신장 장애 연구에 대한 좋은 모델을 만들고, 구조 및 포유류의 대응하는 기능에 유사하고 있습니다.
신장은 신진 대사 액체 폐기물의 시신을 깨끗하게 기관으로 제공, 인간과 다른 척추 동물의 생존에 중요합니다. 이 클렌징 기능은 혈액을 필터하고 분비에 대한 질소 폐기물을 수집 여과물를 수정하고 동시에 유체 및 전해질 균형을 유지하기 위해 신장 nephrons의 능력에 달려있다. Nephrons는 덕트에 혈액 필터, 상피 가느다란 관과 유출로 구성되어 있습니다. 모두 세 부분의 구조와 기능 무결성 nephron의 기능에 필수적인 것입니다. nephrotoxins에 노출, 국소 빈혈 또는 비뇨기 유출 트렉츠의 방해를 포함하여 신장 다양한 모욕, 아키 1 발생할 수 있습니다. 아키의 병리는 종종 급성 관 괴사 1,2와 연결되어 있습니다. 임상 연구는 신장 장애를 다음의 것은 신장 실패의 원인과 상황에 따라 70~80%에서 어디서나 다양 사망률을 가지고 것으로 나타났습니다. 그러나, 아키의 기본 원인 빠른 진단과 반전은 점점 괴사성 nephron의 tubules의 재생을 통해 복구와 관련된 것입니다. 최근 운명 매핑 연구 손상된 nephron의 tubules를 다시 채웁니다 주요 세포 인구가 인접, 손상되지 않은 지역에서 발생한 12 상피 세포는 것을 보여주었다. 이러한 연구 결과는 신장 줄기 / 전구 세포 과정에 참여할 수있는 가능성을 제거하지 않은, 그리고 독립적인 보고서 골수 파생된 세포가 신장 재생 13 기여할 수 있다고 제안했습니다. 그것은 지속적인 조사가 더 신장 상피 세포 재생의 소스를 해결하기 위해 필요한 것이 분명하다.
nephron 재생과 개발 모두 주 mesenchymal와 상피 세포 사이 phenotypes 상태에서 스위치 현상을. nephron 개발하는 동안, mesenchymal 전구 세포가 관 상피 3 양식에 지하 막에 연결, 고정 표현형로 구분. 급성 신장 실패 다음과 상피 세포의 추측 철새 현상 mesenchymal 표현형에 dedifferentiation을 요구. 흥미롭게도 최근 연구 손상된 신장의 mesenchymal 세포가 개발 중에 14 mesenchymal 세포와 유사한 표현 프로필을 전시하는 것이 좋습니다. 다양한 보고서는 세포 접착 분자, 매트릭스 단백질, 크린 시토킨 및 chemokines의 변화를 감지했습니다. 상피 전이에 대한 제안 mesenchymal 따라 전지는 지하 막에 재조 립하고 관 상피 활동을 reinitiate. 이 과정에서 중요한 유전자를 결정하는 것은 우리의 실험실과 다른 사람에 대한 연구의 주제로 계속됩니다. 대부분이 과정의 주요 요소를 명료하게하다하는 작업이 남았지만, 현장에서 상당한 진전이 gentamicin의 효과에 관한 연구로 이동해왔다.
gentamicin에 의한 아키와 신장 장애는 의학 15 사용 nephrotoxic 화합물의 유행을 고려 적합합니다. 그람 음성 세균 감염에 대한 치료로 사용, aminoglycosides의 행정부는 가지 경우 10~25%에서 급성 부상 발생합니다. 약물 함께 많은 관 세포에서 apoptosis 또는 괴사의 결과, 부정적인 세포 효과 과다 발생합니다. 연구 megalin과 endocytosis에 관여 cubulin에 의해 형성된 복잡한 우선적으로 바인딩하는 약물을 발견했습니다. 그들은 이러한 세포의 표현에 국한되지 않습니다하지만 이러한 분자는, 근위 가느다란 관의 상피 세포에서 풍부하게 발견됩니다. 산화 스트레스 유도, vasoconstrictors의 출시, 휴대 ATP, hypoxia의 고갈, phospholipases의 억제의 결과로 세포의 신호 전달을 통해, gentamicin 및 유사 항생제 말이죠상피 세포의 apoptosis와 괴사. 또한, 항생제는 사구체 여과 속도의 드롭 결과 nephron 혈액 필터 (glomerulus)의 mesangial 수축을 트리거하고 부정적인 혈류를 필터링하는 신장의 능력을 변경. 반응 산소 종, immunostimulatory 분자, 그리고 phospholipases의 활성화의 생산은 급성 신장 실패로 연결 치명적인 병리학을 만드는, nephron의 확산 효과를했습니다.
gentamicin 및 이와 유사한 항생 연구가되어 있고 신장 재생 연구에 중요한 도구가 될 계속되지만, 그들은 특정 질문을 해결에 도움이 될 수있는 정밀도를 부족합니다. 이 프로토콜에 설명된 레이저 절제 방식과 함께 zebrafish를 사용하여 우리의 시스템은 정밀한 연구 도구의 필요 대답을 제공합니다. 레이저 박리는 연구자에 이르기까지, 신장 가느다란 관의 focal 분야에서 세포 파괴를 유발 수있는 작은 (2-3) 비교할 수없는 정밀 대형 (> 50-100) 인구에. 이 프로토콜에서는, 우리는 우선적으로 근위 가느다란 관 상피 인구 라벨 dextran – conjugates에 노출 이전에 개발된 방법을 이용한다. 또는 가느다란 관 중 하나 이상의 지역에 녹색 형광 단백질을 표현하는 유전자 변형 zebrafish 라인을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, cadherin17 : eGFP 유전자 변형 zebrafish는 (근위 인구에 불구하고 약한) 말초 가느다란 관의 지역에서 강한 형광을 전시 및 기타 가느다란 관 세그먼트의 재생 연구 16 유용할 수 있습니다. nephron의 가시는 시간이지나면서 세포의 변경 시간 저속 비디오 녹화를 설정합니다. 같은 현장 하이브리드화 또는 immunohistochemistry의 전체 마운트로 유전자 발현 연구와 결합하면, 연구자들은 시간이 지남에 따라 nephron의 분자 변경을 감지할 수 있습니다. 함께 촬영, 이러한 전략은 신장 상피 세포가 파괴되면 발산 이벤트의보다 역동적인 이해를 형성하기 시작할 수 있습니다.
우리의 레이저 박리 모델의 주요 주의해야 할 점은 그것이 인간 아키에 발산 생리적 조건의 일부 측면을 요점을 되풀이 수있다는 것입니다. 순간 물리적 손상으로 유도된 세포 죽음은 세포에 괴사에 이르게 이벤트의 폭포 다른 있으며, 각 microenvironments 이러한 체액성 요소는 동일하지 않을 수 있습니다로. 또한, 거기에 신장 부상 중에 유도된 apoptosis의 증거를 존재하고, 그러한 결과는 레이저로 다음과 같은 모욕을 발산 여부를 알 수 없습니다. 그러나, 단지 세포 배양과 같은 좋은 답변을 몇 가지 매우 통제된 환경이 필요한 질문은 레이저 절제는 매우 아키의 생체내 모델의 제어 역할을 것이라는 도구입니다. 따라서, 통찰력 가능성이 높습 다른 신장 부상의 조사에 적용 가능성이 인간에 더 나은 진단을 만드는 데 사용할 수있는 근본적인 통찰력의 발견을 촉진합니다 zebrafish에서 신장 상피 박리 연구에서 얻고.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그의 메틸 셀룰로오스 제조법을 공유하는 데 유용 아키 생물학 및 zebrafish 기술을 토론하고, C. Diep에 대한 윙거트 연구소의 회원 감사합니다. 저자는 또한 zebrafish 콜로니 우수한 지속적인 축산 관리를 제공하는 Zebrafish 연구 노틀담 센터의 직원에게 우리의 감사를 표현하고 싶습니다. 노틀담 대학에서 시작 자금 NIH – NIDDK 부여 보너스 DK083512하고, 관대한 실험실에서 자금이 작업을 지원합니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Embryo dishes | Falcon | 35-1005 |
| Dissection forceps | Roboz | RS-5010 |
| Injection needles | Sutter Intruments | BF100-50-10 |
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 16500-500 |
| 40 kilodalton (kD) Dextran-fluorescein | Invitrogen | D1845 |
| Plastic transfer pipet | Samco Scientific, Fisher | 204, 13-711-23 |
| Tricaine | Sigma | E10521 |
| Methylcellulose | Sigma | M0262 |
| Depression slide | Fisher | S175201 |
| 12-well dish | Corning | 3512 |
Referências
- Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. Acute renal failure. New Eng. J. Med. 334, 1448-1460 (1996).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am. Soc. Nephrol. 14, 55-61 (2003).
- Dressler, G. R. The cellular basis of kidney development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 509-529 (2006).
- Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-117 (2008).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervos, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, 923-9229 (2005).
- Cosentino, C. i. a. n. c. i. o. l. o., Roman, C., Drummond, B. L., A, I., Hukriede, N. A. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury. J Vis Exp. (42), e2079-e2079 (2010).
- Drummond, I. A., Majumdar, A., Hentschel, H., Elger, M., Solnica-Krezel, L., Schier, A. F., Neuhauss, S. C. F., Stemple, D. L., Zwartkruis, F., Rangini, Z., Driever, W., Fishman, M. C. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125, 4655-4657 (1998).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. , (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394-e1394 (2009).
- Humphreys, B. D., Valerius, M. T., Kobayashi, A., Mugford, J. W., Soeng, S., Duffield, J., McMahon, A. P., Bonventre, J. V. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).
- Bussolati, B., Hauser, P. V., Carvalhosa, R., Camussi, G. Contribution of stem cells to kidney repair. Curr. Stem Cell Res. Therapy. 4, 2-8 (2009).
- Devarajan, P. Update on mechanisms of ischemic acute kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 17, 1503-1520 (2006).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kid. Int. , (2010).
- Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
