腎上皮再生を研究するためにゼブラフィッシュの前腎のレーザーアブレーション

1。ゼブラフィッシュ前腎近位尿細管上皮にラベルを付けるためにマイクロインジェクションの手順 この手順では、我々はその空気圧縮機（6月-エア、モデル6-4）、およびマイクロマニピュレータ装置（Narishege部品MN151、IP3、およびGJI）によって供給される加圧空気を、マイクロインジェクションシステム（ハーバードAppartus、PLI90）を使用あたりの製造業者の指示など、実体顕微鏡ステーション（ニコン、SMZ -ズーム645）で組み立て。デキストランコンジュゲートは、容易にこの上皮細胞集団9の優先的なラベリングを可能にする、ネフロン近位尿細管からエンドサイトーシスされています 。 メチレンブルーへの曝露は、卵黄嚢の自家蛍光を強調し、ネフロンの可視化をより困難細管なることができます。 28.5での受精胚を上げる° Cを48から55時間後に受精（HPF）との間の発達のタイムポイントに。これは、筋肉内マイクロインジェクションを実行させることのできる使いやすさの幼虫のmicroinjectionsを実行するために理想的な段階であり、腎機能は、この時点で開始されるため。 細かいピンセットを使用して、任意の卵からかえっていないゼブラフィッシュから絨毛膜を取り除く。ペトリ皿と詰め替え変更E3ソリューションの30 MLSでディッシュから絨毛膜の破片を洗浄します。 胚の注入トレイを準備します。私達の好まれた射出成形金型は、三角くぼみが胚を注入するための内部に配置することができるように形成されている、1.5％agarose/E3で作られています。射出成形金型を作るために、我々は、1.5％アガロースの基底で満たされたペトリ皿にくさび状の突起（以前11に詳細に記載）でプラスチック金型をフロートさせます。 ゼブラフィッシュブック10に記載の、針の引き手とキャピラリーチューブを引いて、ガラスのマイクロインジェクションの針を準備します。簡単に言えば、実体顕微鏡下で針先を見ながら鋭い点で先端を作るためにマイクロインジェクションの針の先端をカットするために微細な金属の鉗子を使用してガラスキャピラリーチューブを引き出します。ペトリ皿で​​覆われ、面取り部を保護し、ほこりの蓄積を防ぐために、粘土に位置するカットの針を保管してください。 近位尿細管にラベルを付けるために注射液を準備します。蒸留水で1 mg / mLの濃度で40kDのデキストランフルオレセインコンジュゲート（Invitrogen社、D1845）を溶かす。 魚を麻酔するために、E3の30 MLSのゼブラフィッシュ幼生を含むペトリ皿に0.2％Tricaine pH 7.0の5 MLSを追加します。彼らはもはやタッチ応答を示さないときに魚は麻酔する。それは魚が完全に麻酔をかけたり、それらを注入しようとする時にけいれんすることが重要です。 プラスチック製のトランスファーピペットを用いて射出成形金型のトレイに麻酔魚を移す。トランクがよくの傾斜面に沿って置かれていることなども三角形のくぼみの最深部に本社を持つ動物を置き、そしてその側に。 筋肉内マイクロインジェクションを実行します。デキストランフルオレセインの2-3μLとカットの針をロードし、そしてソリューションの約1 NLとトランクの体節に動物を注入する。体節の上部を目指す、と卵黄嚢の拡張子を避ける。これは、ネフロンの尿細管が機械的にマイクロインジェクションのプロセスによって破壊されないようにします。 きれいなペトリ皿に注入したゼブラフィッシュを転送、および修正されたE3のソリューションを追加します。 Tricaineのすべてのトレースを削除するには、新鮮なE3での動物を3回すすいでください。デキストランのために光保護を提供し、一晩28℃インキュベーターに動物を戻すためにアルミ箔付きペトリ皿の蓋をカバーしています。 2。近位尿細管細胞の標的とレーザーアブレーション この手順では、我々は、デキストランフルオレセイン明るく標識近位尿細管での動物をスコアとレーザーアブレーションのためにこれらを選択するには落射蛍光と実体顕微鏡を使用してください。その後、我々は、ネフロンのセルのアブレーションを行うために、化合物の顕微鏡（落射蛍光添付ファイル付きのニコンエクリプス80I）に接続されている、とあたりの製造業者の指示として使用するために校正されたパルスmicropointのレーザーシステム（フォトニックインスツル株式会社）を使用します。我々は、明視野照明の下で蛍光管の領域を表示するには、研究者を可能にするFITCフィルターを使用して、セルのアブレーションで最も成功を収めている。 この手順の事前に、0.02％tricaine/E3で1.5％のメチルセルロースを溶解することによりアブレーション用固定化担体を準備。室温ですぐに使用するためにメチルセルロースの店舗のアリコート、または4℃で長期保存のため。 E3 30 MLSのゼブラフィッシュ幼生を含むペトリ皿に0.2％Tricaine pH 7.0の5 MLSを追加することで、72 HPFのゼブラフィッシュを麻酔。彼らはもはやタッチ応答を示さないときに魚は麻酔する。それは魚が完全に麻酔をかけたり、レーザーアブレーションを実行しようとする時にけいれんすることが重要です。 </LI> 適切な蛍光灯の設定の下に注入された動物を調べて、簡単に近位尿細管を可視化できる動物を選択します。 tricaineを含む別の皿に、選択した胚を移す。最大30分間細胞アブレーションを実行する前に、動物は麻酔することができます。あなたが> 15匹を獲得した場合、各セルのアブレーションには数分かかるとして、アブレーションを待っている間に新しい改変E3を含む別の皿にこれらを返す。 アブレーションを実行するには、固定化担体で胚を洗浄するために2分間、1.5％methylcellulose/0.02％tricaineを含む小さなペトリ皿一つ麻酔ゼブラフィッシュを転送する。 次に、1.5％methylcellulose/0.02％tricaineのドロップを含むガラスのうつ病のスライドに胚を移す。静かにその腹側はスライドと背側が上を向いて対向するように微細なプローブを用いて動物を配置します。 compund顕微鏡のステージ上でスライドを配置し、動物の背側に焦点を当てます。フットペダル操作でのフォーカスの下ネフロン細胞の切除を行います。腎上皮細胞（図1A）アブレーションされているように、蛍光の分散が表示されます。 ゆっくりとその後の培養用12ウェルディッシュにウェルに切除動物を譲渡する。メチルセルロースを洗い流すためにE3を2〜3回すすいでください。 注入後は、希望するタイムポイントに動物を上げ、若いゼブラフィッシュの胚（図2）のための確立された組織学的および分子生物学的手法に従って、目的の分析を行う。 3。代表的な結果： 図1に示されているデータは、アブレーションのtimecourseを示している。デキストランコンジュゲートと筋肉内注射した後、近位尿細管が優先的にラベルが付いています。デキストラン- FITCの注入は、レーザーアブレーションのための腎臓を標識するために使用され、切除動物が近位尿細管の人口を再イメージする一つの追加タイムポイント以下のアブレーションでデキストラン-ローダミンを再注入した。 in situハイブリダイゼーションのような発現解析の手法は、図2に示すように細胞のアブレーションに続く単一の時点においての固定サンプルの変化を、分析するために使用することができます。 図1：レーザーアブレーションの手順は、尿細管上皮の迅速な再生が続きます （AC）の間に細胞の変化のTimecourseとアブレーションの時間（3日目、パネルA）におけるゼブラフィッシュ幼生近位尿細管のレーザーアブレーションに続いて、または1つまたは3つ。日後のアブレーション（4日目、パネルB、7日目、パネルC）。 （トップ）の回路図には、デキストラン- FITC（緑）とデキストラン-ローダミン（赤）と、ネフロンの位置を示し、（底部）の制御とレーザーアブレーション（LA）ネフロンのライブ映像。 図2：レーザーアブレーションは、次の遺伝子発現の解析 3日目で、次のレーザーアブレーションは、胚は、ネフロンの近位尿細管のセグメントをマークslc20a1aための転写産物を検出するin situハイブリダイゼーション全体マウントによって固定し、処理した。 （A）レーザーアブレーションを受けていなかったコントロール胚では、尿細管上皮の大規模なストレッチがアブレーションされた（B）胚、および尿細管上皮の短い間隔がアブレーションされた（C）胚。黒のラインが基準を提供するために近位尿細管の程度を示す、ブルーのラインは、パネルBCでのレーザーアブレーションの程度を示す、*は対照​​（非切除）のパネルBCの対側ネフロンを示している。