إصابة الكلى الحاد (كونا) في البشر مشكلة شائعة السريرية الناجمة عن الأضرار التي لحقت الخلايا الظهارية التي تشكل النيفرون الكلى ، ويرتبط آكي مع ارتفاع معدلات الوفيات من 50-70 ٪<sup> 1</sup>. بعد تدمير الخلايا الظهارية ، النيفرون لديهم قدرة محدودة على التجدد ، على الرغم من تبقى غير مفهومة تماما الآليات والقيود التي توجه هذه الظاهرة. في هذه المقالة الفيديو ، ونحن لدينا وصف تقنية الليزر التذرية التي تستهدف خلايا الكلى نفرون في الكلى الجنين الزرد ، أو سليفة الكلوة. يمكن استخدام الأسلوب الجديد لاستكمال الكلوي الناجم عن النماذج من AKI ، واكتساب فهم عالية الدقة من الخلية والتعديلات الجزيئية التي ترتبط مع التجدد الظهارية في نفرون الكلوي.
يتميز إصابة الكلى الحاد (كونا) عن طريق ارتفاع معدلات الوفيات من تدهور وظائف الكلى على مدى ساعات أو أيام والذي يبلغ ذروته في الفشل الكلوي 1. يمكن أن يكون سبب الفشل الكلوي الحاد من جانب عدد من العوامل من بينها نقص التروية سمية الدواء ومقرها ، أو إصابات معوقة 1. هذه النتائج في عدم القدرة على الحفاظ على توازن السوائل والكهارل. في حين لوحظ AKI لعقود ، والعلاجات السريرية فعالية ما زال يتعين تطويرها. يثير الاهتمام والفضول ، وبعض المرضى الذين يعانون من استعادة وظائف الكلى آكي مع مرور الوقت ، وهي ظاهرة الغامضة التي تم rudimentally تتميز فقط 1،2. وقد أظهرت الأبحاث باستخدام نماذج من الثدييات AKI أن نقص تروية الكلى أو جرح ، nephrotoxin تجربة موت الخلايا الظهارية في نبيبات نفرون 1،2 ، وحدات وظيفية في الكلى التي تتكون من سلسلة من المناطق المتخصصة (شرائح) من أنواع الخلايا الظهارية 3 . في غضون النيفرون ، موت الخلايا الظهارية هو أعلى في الخلايا نبيب القريبة. هناك أدلة توحي بأن يتبع تدمير الخلية فقد التمايز ، والانتشار ، وهجرة الخلايا الظهارية المحيطة بها ، والتي يمكن تجديدها بالكامل نفرون 1،2. ومع ذلك ، هناك الكثير من علامات الاستفهام حول آليات التجديد الظهارية الكلوية ، بدءا من الاشارات التي تعدل هذه الأحداث لأسباب الاختلاف واسعة من القدرات بين البشر لتجديد الكلى الجرحى.
والزرد اليرقات يقدم نموذجا ممتازا لدراسة تجديد الكلى الظهارية ويتكون من الكلى لسليفة النيفرون التي يتم حفظها مع ارتفاع 4،5 الفقاريات بما فيها الثدييات. يمكن لليرقات النيفرون الزرد يمكن تصور مع تقنيات مضان بسبب الشفافية النسبية للالزرد الشباب 6. وهذا يوفر فرصة فريدة لخلية الصور والتغيرات الجزيئية في الوقت الحقيقي ، على النقيض من نماذج الثدييات النيفرون حيث لا يمكن الوصول إليها بسبب الكلى والنظم المعقدة هيكليا منضوية تحت لواء الحيوانية. استخدمت الدراسات التي أجريت مؤخرا في جنتاميسين أمينوغليكوزيد كوكيل أعمال للالسامة المسببة لدراسة آكي والفشل الكلوي لاحقا : لقد ثبت جنتاميسين والمضادات الحيوية الأخرى لسبب AKI في البشر ، والباحثين قد وضعت وسائل لاستخدام هذا العامل لتحريك تلف الكلى في الزرد 7 (8). ومع ذلك ، فإن التأثيرات السمية أمينوغليكوزيد اليرقات في الزرد كارثية وقاتلة ، مما يشكل صعوبة عند دراسة تجديد الظهارية وظيفة مع مرور الوقت. أسلوبنا يعرض استخدام الاجتثاث الخلية المستهدفة كأداة لدراسة الرواية الإصابة الظهارية في الزرد. الليزر التذرية يعطي الباحثين القدرة على إحداث موت الخلايا في مجموعة سكانية محدودة من الخلايا. يمكن استهداف مناطق مختلفة من الخلايا بناءا على الموقع الصرفية ، وظيفة ، أو حتى التعبير عن النمط الظاهري خلوي معين. وبالتالي ، فإن الاقتلاع بالليزر زيادة خصوصية ما يمكن للباحثين دراسة ، ويمكن أن يكون طريقة فعالة جديدة لتسليط الضوء على آليات التجدد الظهارية الكلوية. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على نطاق واسع لاستهداف السكان الخلية في الأجهزة الأخرى في الجنين الزرد لدراسة الإصابات والتجدد في أي عدد من سياقات الفائدة.
والزرد هو كائن النموذج المستخدم على نطاق واسع في جميع أنحاء العديد من جوانب العلم ، والتطبيقات التي تنمو 6. وقد أدى توظيف في النظام النموذجي الزرد في دراسة أمراض الكلى مثل الفشل الكلوي الحاد على الملاحظات الهامة وسوف تستمر في أن تكون نموذجا جيدا لدراسة إصابة الكلى 7،8. مع الجينوم الذي تم التسلسل والبروتوكولات الجزيئية كثيرة في المكان ، أصبح من السهل على نحو متزايد لتنفيذ البحوث المتطورة التي تستخدم الزرد النماذج المعدلة وراثيا ، ضربة قاضية الجينات ودراسات misexpression. والزرد لديه دورة حياة قصيرة مع الأحجام الكبيرة وجيل محددة جيدا المراحل التنموية. وعلاوة على ذلك ، والمراحل الجنينية الزرد واليرقات وشفافة إلى حد كبير ، مما يجعل دراسات التصوير ممكنا من دون تشريح للكائن. طوال المراحل الجنينية واليرقات ، والزرد والكلى سليفة تتألف من اثنين من النيفرون ، التي تبقى واضحة خلال هذه timepoints التنموية. الزرد النيفرون سليفة هي مشابهة في التركيب والوظيفة لنظرائهم من الثدييات ، مما يجعلها نموذجا جيدا للدراسات الفشل الكلوي الحاد 4،5.
الكلى أمر حاسم لبقاء البشر والفقاريات الأخرى ، بوصفه الجهاز الذي يطهر الجسم من النفايات السائلة الأيض. هذه المهمة تقع على التطهير قدرة النيفرون الكلى لتصفية الدم ، ومن ثم تعديل رشاحة يقوم بجمع النفايات النتروجينية لإفراز والحفاظ في نفس الوقت توازن السوائل والكهارل. وتتألف النيفرون لتصفية الدم ، أنبوبية الظهارية ، وتصب في قناة و. السلامة الهيكلية والوظيفية لجميع الأجزاء الثلاثة جزء لا يتجزأ من وظيفة نفرون. يمكن الشتائم المختلفة إلى الكلى ، بما في ذلك التعرض للnephrotoxins ، نقص التروية ، أو عرقلة تدفق البول نتيجة مساحات في AKI 1. وكثيرا ما يرتبط في علم الأمراض من AKI مع 1،2 نخر أنبوبي حاد. وقد أظهرت الدراسات السريرية التي تلت ذلك الفشل الكلوي لديها معدل وفيات الأطفال التي يمكن أن تتراوح في أي مكان 7-80 ٪ اعتمادا على سبب وسياق الفشل الكلوي. ومع ذلك ، يرتبط على نحو متزايد التشخيص السريع وعكس السبب الكامن وراء الانتعاش مع AKI عبر تجديد نبيبات نفرون نخرية. وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن تعيين مصير السكان الخلية الرئيسية التي repopulates نبيبات نفرون معطوبة الخلايا الظهارية التي تنشأ من المناطق المجاورة لم يصب 12. هذه النتائج لم تكن قد قضت على احتمال أن الكلوي الجذعية / السلف الخلايا يمكن أن تشارك في هذه العملية ، وتقارير مستقلة اشارت الى ان خلايا نخاع العظام المستمدة يمكن أن تسهم في تجديد الكلوي 13. فمن الواضح أن هناك حاجة لاستمرار التحقيقات في حل أفضل مصادر التجدد الخلوي الظهارية الكلوية.
كلا نفرون التجدد والتنمية حصة ظاهرة تبديل في ولاية الخلوية بين الظواهر الوسيطة والظهارية. أثناء تطوير نفرون ، وخلايا اللحمة المتوسطة السلف التمايز إلى النمط الظاهري ثابتة ، لربط الغشاء القاعدي لتشكيل الظهارة الأنبوبية 3. وتكهنت ظاهرة هجرة الخلايا الظهارية في أعقاب فشل كلوي حاد يستوجب فقد التمايز إلى النمط الظاهري الوسيطة. ومن المثير للاهتمام ، فإن الدراسات الحديثة تشير الى ان خلايا اللحمة المتوسطة في الكلى التالفة يحمل ملف تعريف التعبير مماثلة إلى خلية الوسيطة خلال التنمية 14. وقد كشفت تقارير مختلفة التغييرات في خلية التصاق جزيئات البروتينات المصفوفة ، والسيتوكينات chemokines. بعد الوسيطة المقترحة للانتقال الظهارية وخلايا يحشدوا على الغشاء القاعدي ومعاودة نشاطات الظهارية الأنبوبية. تحديد الجينات المهم في هذه العملية لا تزال موضوعا للبحث عن المختبر وغيرها. الكثير من العمل لتوضيح العوامل الرئيسية في هذه العملية لا يزال يتعين القيام به ، ولكن تم بشرت تقدما كبيرا في المجال من خلال دراسة آثار الجنتاميسين.
AKI والفشل الكلوي الناجم عن جنتاميسين وثيق الصلة بالنظر إلى انتشار مجمعات كلى تستخدم في الطب 15. تستخدم كعلاج للسالبة الجرام الالتهابات البكتيرية ، وإقامة الأمينوغليكوزيد يؤدي الى الاصابة الحادة في 10-25 ٪ من الحالات. هذا الدواء يسبب مجموعة كبيرة من الآثار السلبية الخلوية ، مما أدى إلى موت الخلايا المبرمج معا أو نخر في خلايا أنبوبية عديدة. وقد وجدت الدراسات المخدرات لربط تفضيلي لمجمع شكلتها megalin cubulin والتي تشارك في الإلتقام. تم العثور على هذه الجزيئات في وفرة في الخلايا الظهارية للنبيب القريبة ، على الرغم من أنها لا تقتصر على التعبير في هذه الخلايا. من خلال الإشارات الخلوية مما أدى إلى تحريض الاكسدة ، وإطلاق سراح vasoconstrictors ، ونضوب ATP الخلوية ، ونقص الأكسجين ، وتثبيط phospholipases ، والمضادات الحيوية وجنتاميسين تسبب مماثلةموت الخلايا المبرمج ونخر في الخلايا الظهارية. بالإضافة إلى ذلك ، والمضادات الحيوية يؤدي الانكماش مسراق الكبيبة في تصفية الدم نفرون (الكبيبة) ، مما أدى إلى انخفاض في معدل الترشيح الكبيبي وتغيير سلبا على قدرة الكلى على تصفية الدم. إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية ، والجزيئات immunostimulatory ، وتفعيل phospholipases آثار منتشر في نفرون ، وخلق أمراض الكارثية التي تؤدي إلى فشل كلوي حاد.
في حين أن دراسات مشابهة للمضادات الحيوية والجنتاميسين كانت وستظل أدوات مهمة للبحوث التجديد الكلى ، وأنها تفتقر إلى الدقة التي يمكن أن تكون مفيدة في معالجة بعض المسائل. نظامنا باستخدام الزرد بالتزامن مع الليزر التذرية طريقة المبينة في هذا البروتوكول يجيب على الحاجة لمثل هذا أداة بحث دقيقة. الليزر التذرية يسمح للباحثين للحث على تدمير خلايا في المناطق المحورية للنبيب كلوي ، بدءا من الصغيرة (2-3) إلى السكان (> 5-10) كبير ، مع دقة لا تضاهى. في هذا البروتوكول ، ونحن نستخدم طريقة تم تطويرها من قبل التعرض لديكستران – تقارن تفضيلي لتسمية السكان نبيب القريبة الظهارية. بدلا من ذلك ، يمكن أن تستخدم خطوط الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء في واحدة أو أكثر من المناطق نبيب. على سبيل المثال ، cadherin17 : eGFP المعدلة وراثيا يحمل الزرد مضان قوي في المناطق البعيدة نبيب (على الرغم من ضعف في السكان القريبة) ، ويمكن أن تكون ذات قيمة للدراسات التجديد في قطاعات أخرى نبيب 16. سيتم تسليط الضوء على تمكين نفرون الوقت الفاصل بين تسجيل الفيديو من التغيرات الخلوية مع مرور الوقت. عندما يقترن دراسات التعبير الجيني مثل جبل بأكمله في الموقع التهجين أو المناعية ، يمكن للباحثين الكشف عن التغيرات الجزيئية في نفرون مع مرور الوقت. أخذت معا ، يمكن أن تبدأ مثل هذه الاستراتيجيات لصياغة فهم أكثر ديناميكية من الأحداث التي ترشح عندما يتم تدمير الخلايا الظهارية الكلوية.
التحذير الرئيسية لدينا نموذج الليزر التذرية هي أنه قد ألخص جوانب جزئية من الظروف الفسيولوجية التي ترشح في AKI الإنسان. وفاة الخلية من خلال الأضرار المادية الناجمة عن حظية يختلف عن سلسلة من الأحداث التي تؤدي إلى نخر في الخلايا ، وعلى هذا النحو العوامل الخلطية في هذه microenvironments مختلفة قد لا تكون متطابقة. بالإضافة إلى ذلك ، توجد أدلة على موت الخلايا المبرمج بفعل الاصابة خلال الكلى ، وليس من المعروف ما إذا كانت هذه الآثار ارشح إهانة التالية مع الليزر. ومع ذلك ، تماما كما خلية ثقافة هو أداة أفضل إجابات بعض الأسئلة التي تتطلب بيئة محكومة إلى حد كبير ، التذرية الليزر ستكون بمثابة رقابة شديدة A في الجسم الحي من طراز AKI. على هذا النحو ، حصل على رؤى من الدراسات الكلوي الاجتثاث الظهارية في الزرد سيعزز احتمال اكتشاف الأفكار الأساسية التي يمكن تطبيقها على التحقيقات عن وقوع اصابات الكلوي الأخرى والتي يحتمل استخدامها لخلق أفضل التشخيص لدى البشر.
The authors have nothing to disclose.
نشكر أعضاء المختبر لاجراء مناقشات مفيدة Wingert البيولوجيا آكي الزرد والتقنيات ، وديب جيم لتبادل وصفته methylcellulose. الكتاب كما أود أن أعرب عن امتناننا للموظفين في مركز نوتردام للبحوث اسماك الزرد لتوفير الرعاية الممتازة تربية الجارية لمستعمرة الزرد لدينا. يؤيد التمويل من منح الجائزة NIH – NIDDK DK083512 ، ومختبر السخي البدء بتمويل من جامعة نوتردام ، وهذا العمل.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Embryo dishes | Falcon | 35-1005 |
Dissection forceps | Roboz | RS-5010 |
Injection needles | Sutter Intruments | BF100-50-10 |
Ultrapure agarose | Invitrogen | 16500-500 |
40 kilodalton (kD) Dextran-fluorescein | Invitrogen | D1845 |
Plastic transfer pipet | Samco Scientific, Fisher | 204, 13-711-23 |
Tricaine | Sigma | E10521 |
Methylcellulose | Sigma | M0262 |
Depression slide | Fisher | S175201 |
12-well dish | Corning | 3512 |