تشريح الكلى اسماك الزرد الكبار
Summary
الكلى الزرد هي موطن كل من الخلايا الجذعية المكونة للدم والكلى / السلف الكبار ، ويمثل فرصة رائعة لدراسة هذه الخلية أنواع وذريتها في الفقاريات الحي النموذجي. هنا ، علينا أن نظهر إجراء تشريح التفصيلية التي تمكن الباحث من تحديد وإزالة جراحيا الكلى الزرد الكبار ، والتي يمكن استخدامها لتطبيقات مثل عزل الخلايا ، وزرع ، ودراسات التعبير و / أو السكان الكلى خلايا الدم.
Abstract
الباحثين العاملين في حقل يزدهر بيولوجيا الخلايا الجذعية للبالغين يسعون لفهم الإشارات التي تنظم السلوك وظيفة الخلايا الجذعية خلال التوازن الطبيعي والحالات المرضية. فهم الخلايا الجذعية البالغة والآثار واسعة المدى على مستقبل الطب التجديدي 1. على سبيل المثال ، يمكن معرفة أفضل عن الكبار بيولوجيا الخلايا الجذعية تسهيل تصميم الاستراتيجيات العلاجية التي يتم تشغيلها في أجهزة لعلاج أنفسهم أو حتى إيجاد طرق لأجهزة المتنامية في المختبر التي يمكن زرعها في البشر 1. أصبحت نموذجا الزرد الحيوان القوي لدراسة بيولوجيا الخلايا الفقاريات 2. كانت هناك وثائق مستفيضة وتحليل التطور الجنيني في الزرد 3. إلا أن العلماء في الآونة الأخيرة سعى إلى توثيق التشريح الكبار والتقنيات الجراحية تشريح 4 ، كما كانت هناك حركة التقدمية داخل المجتمع الزرد لتوسيع تطبيقات هذا الكائن البحوث للدراسات الكبار. على سبيل المثال ، هناك توسع في استخدام المصالح الزرد للتحقيق في بيولوجيا الخلايا الجذعية للبالغين من السكان وتقديم نماذج متطورة من البالغين بأمراض مثل سرطان 5. تاريخيا ، تم عزل الكلى الكبار الزرد مفيدة لدراسة تكون الدم ، والكلى هو الموقع التشريحي للإنتاج خلايا الدم في الأسماك 6،7. تتألف من وحدات الكلى نفرون الفنية موجودة في ترتيبات arborized ، وتحيط بها الأنسجة المكونة للدم التي تتوزع في جميع أنحاء المسافات الفاصلة. مكون للدم يتكون من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) وذريتها التي تعيش في الكلى حتى يفرق عضال 8. بالإضافة إلى ذلك ، ويقدر الآن أن مجموعة من الخلايا الجذعية / السلف كلوي (محاولات RPCs) تسكن أيضا الجهاز الكلوي الزرد وتمكين كل من التجدد والنمو الكلى ، كما لوحظ في أنواع الأسماك الأخرى 9-11. في ضوء هذا الاكتشاف الجديد ، والكلى الزرد واحد الجهاز الذي يضم الموقع اثنين من الفرص المثيرة للبالغين دراسات بيولوجيا الخلايا الجذعية. فمن الواضح أنه يمكن عمل الكثير من المسائل العالقة بشكل جيد مع هذا النظام التجريبي. لتشجيع التوسع في هذا المجال ، من المفيد لتوثيق مفصل لطرق تصور ثم عزل الكلى الزرد الكبار الجهاز. تفاصيل هذا البروتوكول إجراء تشريح لدينا في الكلى الكبار على حد سواء من الحيوانات غير الثابتة والثابتة. ويمكن استخدام تشريح الجهاز الكلوي لعزل وتوصيف الخلايا الجذعية المكونة للدم والكلى وذريتهم باستخدام تقنيات معروفة مثل الأنسجة ، مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) 11،12 ، 13،14 التنميط التعبير ، والزرع 11،15. نأمل أن نشر هذا البروتوكول سيتيح للباحثين معرفة أوسع لتنفيذ استخدام دراسات الزرد التي يمكن ترجمتها في نهاية المطاف للتطبيق البشري.
Protocol
Discussion
الخلايا الجذعية البالغة هي مكونات حيوية وأساسية التي تحافظ على شكل الجسم البالغ 1. يمكن أن الخلايا الجذعية تستخدم أيضا لمواجهة الأضرار التي تتحملها الدول الجسم أثناء المرض ، وضعف أو فقدان الخلايا الجذعية البالغة يمكن ان يؤدي الى انخفاض وظيفة الجهاز والتي تورطت في دفع الأورام الخبيثة السرطانية وتسهم في الشيخوخة. الخلايا الجذعية البالغة خواص الخلوية التي تميزها عن أنواع الخلايا المتمايزة. بناء على انقسام الخلايا ، والخلايا الجذعية البالغة هي قادرة على التجديد الذاتي وإنتاج الخلايا الاصلية التي بدورها يمكن أن تؤدي إلى نسل متباينة متميزة. هناك اهتماما كبيرا في فهم مسارات اتخاذ القرارات التي تنظم مصير الخلية وفعالية من الخلايا الجذعية للبالغين بسبب دورهم المهم في توازن الأنسجة 1. على سبيل المثال ، العديد من العلماء يسعون حاليا للتعرف على الإشارات التي تحافظ على خلايا مختلفة من السكان البالغين الجذعية في مكانها المناسب ، أو المكروية المتخصصة ، وكيف أثرت هذه العوامل الخلطية الكوة.
الكبار الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) هي خلايا متعددة الإمكانات التي تغذي التجديد المستمر لخلايا الدم في الحيوانات 8. تكون الدم هي عملية حيوية ومستمرة باستمرار خلال حياة الكائن الفقاريات لأن خلايا الدم الناضجة أنواع متباينة قصيرة الأجل ، وبالتالي يجب أن تتجدد بشكل منتظم. لأنها تفرق ، HSCs توريد هذا الطلب حاسما عن طريق تجديد الذات وإنتاج سلسلة من الأسلاف التي تؤدي إلى محمر ، الأنساب النواء ، اللمفاوية والدم النخاعي. كل هذه الأنواع من خلايا الدم يؤدي وظائف فريدة من نوعها في الدورة الدموية ، بما في ذلك توفير تبادل الغازات في الأنسجة ، وسيلة لمنع تسرب اصابات في الأوعية الدموية عن طريق تكوين جلطة ، أو آليات الدفاع ضد غزو الجراثيم. في حين تم الاعتراف HSCs لسنوات عديدة ، وعدد كبير من الأسئلة لا تزال دون إجابة رائعة حول هذه الخلايا مدهشة. وقد حددت الدراسات التي أجريت مؤخرا من HSCs فرعية مختلفة مع خصائص ذاتية التجديد على المدى الطويل ، والكشف عن المكونات المتخصصة والإشارات التي تعدل سلوك HSC 8. والزرد هو الآن من بين الركائز الأساسية لنماذج بحثية تكون الدم ، على أساس الصفات الوراثية والجزيئية لهذا النموذج الحيوان 8. وقد أدت البحوث الاستفادة من الزرد إلى رؤى جديدة حول البيولوجيا شهادة الثانوية العامة التي يتم حفظها مع ارتفاع الفقاريات مثل الثدييات ، مع التشديد على أهمية الطب الحيوي التحقيقات الدم الأسماك 8.
تاريخيا ، والمعارف حول HSCs قد مهد الطريق لحملات تسعى لاكتشاف ما إذا كان يتم الاحتفاظ أجهزة الجسم الأخرى من الخلايا الجذعية للبالغين. ويقدر الآن العديد من السكان البالغين الخلية الجذعية في الوجود ، التي تمتد عبر هياكل متنوعة من الدماغ إلى الأمعاء والجلد والعضلات والهيكل العظمي. مواصلة بذل الجهود في مجال الخلايا الجذعية وتسعى إلى تحديد كيفية خلايا جذعية للبالغين وغيرها من أنواع الخلايا المختلفة حتى يمكن عرض قوة معززة في مختلف البيئات.
فيما يتعلق الكلى ، وكان هناك نقاش كبير بين الكلى ما إذا كان وجود خلايا جذعية الكلوي 16. وقد وثقت نتائج مستقلة السكان من خلايا الكلى في الثدييات التي تمتلك درجات متفاوتة من إمكانات التجدد ، ولكن فهم متماسك من هذه التقارير لم يتحقق بعد. ومن المثير للاهتمام ، وهناك أدلة قوية لدعم الفكرة القائلة بأن العديد من أنواع الأسماك التي يمكن أن تمتلك خلايا الوقود بقوة تجديد النيفرون المتضررة ، فضلا عن النمو النيفرون جديدة كليا خلال مرحلة البلوغ 9. وقد حددت الأعمال الأخيرة بصمات الجزيئي للخلايا الجذعية للبالغين في الكلى 10،11 الزرد ، وبرهنت على فاعلية الذات تجديد هذه الخلايا الجذعية ما يسمى / السلف كلوي (محاولات RPCs) 11. هناك حاجة لدراسات المستقبل للتأكد مما إذا كانت خلايا الكلى مماثلة موجودة في الثدييات. ومع ذلك ، فقد استمرت التحقيقات حول الآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم محاولات RPCs الأسماك توفير نظرة ثاقبة كيف يمكن حفز التجدد المفاخر في الكلى الثدييات. فمن الواضح أنه لا يزال هناك الكثير الذي ينبغي فهمه حول محاولات RPCs ، والتي يمكن تنفيذها في العديد من الأدوات المتاحة الآن للباحث الزرد لمعالجة هذه المسائل المثيرة للاهتمام.
في هذا البروتوكول ، ونحن لدينا وصف طريقة لتحديد التشريحية وتشريح الكلى الزرد الكبار. ويمكن استخدام خطوات بديلة لتشريح الكلى ، مثل فتح التجويف البطني مع شق بطني باستخدام مقص التشريح ، ولكن واجهتنا أكثر نجاحا في الحصول على كامل الكلى عند دبس فتح جدار البطن ويتم إزالة الرأس. الدم والكلى ويمكن الباحثين على حد سواء الذين يرغبون في عزل والعمل مع هذه أنواع الخلايا إما استخدام أسلوب تشريح. تجدر الإشارة إلى أن الأسلوب وصفنا من أجل عزل وركينومن المؤكد غ مع الكلى الكبار الزرد لا تقتصر على العلماء الذين يرغبون في متابعة المسائل الكبار بيولوجيا الخلايا الجذعية ، وتشريح هذا الجهاز يمكن أن تسهل هذه الدراسات للباحثين متابعة التحقيقات حول مواضيع تتراوح بين علم وظائف الأعضاء في الشيخوخة. كذلك ، يمكن أن يقترن هذا الأسلوب مع تكنولوجيات أخرى مثل البذور المعدلة وراثيا ، وذلك لتسمية جزيئيا ثم تنقية ودراسة المجموعات السكانية الفرعية منفصلة من خلايا الدم أو الكلى أو وراثيا من wildtype الزرد متحولة 11. نتطلع ، مثل تنقية الإجراءات التفصيلية لأنواع الخلايا الجذعية والسلف هو أمر حيوي لكسب المعرفة حول كيفية تنظيم سلوكهم ، والتجارب التشغيلية مثل زرع أو زراعة السلف تشكل الأساس الذي يعرف قوة وهوية هذه الخلايا. التطورات الحديثة في أساليب لدم ثقافة السلف فتح آفاقا جديدة لكثير من الدراسة ، ويمكن تكييفها لزراعة الكلى للسكان 17. وقد الزرد الوراثة الكيميائية ناجحة في تحديد المسارات التي تعدل HSCs والأسلاف الكلوي في سياقات مختلفة 18-20 ، وستظل وسيلة مفيدة لاختبار في تركيبة مع تقنيات البيولوجيا الخلوية أعلاه. أخذت معا ، كان هناك عدد من المساهمات الرائدة في مجال أمراض الدم وأمراض الكلى باستخدام نموذج الزرد ، واستمر البحث في هذه المجالات وعود إلى رؤى تمارس تحويلية أخرى في السنوات المقبلة.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RAW يود أن أشكر أعضاء زون ومختبرات البحوث ديفيدسون لما قدموه من مساهمات لا تحصى للمساعدة على وضع استراتيجيات والتي شكلت تدريجيا هذه التقنية في تشريح الزرد الكبار على مدى العقد الماضي. بالإضافة إلى ذلك ، نود أن نعرب عن امتناننا لموظفي مركز نوتردام للبحوث اسماك الزرد لتوفير الرعاية الممتازة تربية الجارية لمستعمرة الزرد لدينا. حصل RAW تمويل البحوث من منح الجائزة NIH – NIDDK DK083512 ، ومختبر السخي البدء بتمويل من جامعة نوتردام.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Dissection scissors | Roboz | RS-5882 |
| Dissection forceps | Roboz | RS-5010 |
| Dissection angled forceps | Roboz | RS-5058 |
| Tricaine | Sigma | E10521 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 |
Referências
- Stocum, D. L., Zupanc, G. K. Stretching the limits: stem cells in regeneration science. Dev. Dyn. 237, 3648-3671 (2008).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Mione, M. C., Trede, N. S. The zebrafish as a model for cancer. Dis. Model Mech. 3, 517-523 (2010).
- Zon, L. I. Developmental biology of hematopoiesis. Blood. 86, 2876-2891 (1995).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The ‘definitive’ (and ‘primitive’) guide to zebrafish hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
- Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. I. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Weber, G. J., Choe, S. E., Dooley, K. A., Paffett-Lugassy, N. N., Zhou, Y., Zon, L. I. Mutant-specific gene programs in the zebrafish. Blood. 106, 521-530 (2005).
- Sumanas, S., Jorniak, T., Lin, S. Identification of novel vascular endothelial-specific genes by the microarray analysis of the zebrafish cloche mutants. Blood. 106, 534-541 (2005).
- Burns, C. E., Traver, D., Mayhall, E., Shepard, J. L., Zon, L. I. Hematopoietic stem cell fate is established by the Notch-Runx pathway. Genes Dev. 19, 2331-2342 (2005).
- Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
- Stachura, D. L., Reyes, J. R., Bartunek, P., Paw, B. H., Zon, L. I., Traver, D. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- North, T. E., Goessling, W., Walkley, C. R., Lengerke, C., Kopani, K. R., Lord, A. M., Weber, G. J., Bowman, T. V., Jang, I. H., Grosser, T. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- de Groh, E. D., Swanhart, L. M., Cosentino, C. C., Jackson, R. L., Dai, W., Kitchens, C. A., Day, B. W., Smithgall, T. E., Hukriede, N. A. Inhibition of histone deacetylase expands the renal progenitor cell population. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 794-802 (2010).
