La cuantificación de proteínas mediante el enriquecimiento de inmunoafinidad péptido acoplado a espectrometría de masas
Summary
Normas de isótopos estables y de captura de anticuerpos anti-péptido (SISCAPA) enriquecimiento de las parejas de afinidad de los péptidos con una dilución de isótopos estables de espectrometría de masas (MRM-MS) para proporcionar una medición cuantitativa de los péptidos como sustitutos de sus respectivas proteínas. A continuación se describe el protocolo de uso de partículas magnéticas en un formato parcialmente automatizado.
Abstract
Hay una gran necesidad de ensayos cuantitativos en la medición de las proteínas. Inmunoensayos tradicional bocadillo, en gran medida considera el estándar de oro en la cuantificación, se asocian con un alto costo, larga duración, y están llenos de inconvenientes (por ejemplo, anticuerpos heterófilos, la interferencia de autoanticuerpos, 'gancho-efecto "). 1 Una técnica alternativa es el enriquecimiento de afinidad de péptidos acoplada a espectrometría de masas cuantitativa, comúnmente conocida como SISCAPA (Normas de isótopos estables y captura de anticuerpos anti-péptido). 2 En esta técnica, el enriquecimiento de afinidad de los péptidos con una dilución de isótopos estables y de detección por determinados / espectrometría de masa de reacción múltiple de control ( SRM / MRM-MS) proporciona una medición cuantitativa de los péptidos como sustitutos de sus respectivas proteínas. SRM / MRM-MS está bien establecida para la cuantificación exacta de las moléculas pequeñas 3, 4 y más recientemente ha sido adaptado para medir las concentraciones de proteínas en el plasma y lisados celulares. 5.7 Para lograr la cuantificación de las proteínas, las moléculas de mayor tamaño son digeridos a péptidos componente usando una enzima como la tripsina. Uno o más péptidos seleccionados cuya secuencia es única a la proteína diana en la especie (es decir, "proteotypic" péptidos) son continuación de la muestra enriquecida con anticuerpos anti-péptido y se mide como sustitutos estequiométrica cuantitativa de la concentración de proteínas en la muestra. Por lo tanto, junto a la dilución de isótopos estables (SID) métodos (es decir, una enriquecida en isótopos estables etiquetados péptido estándar), SRM / MRM se puede utilizar para medir las concentraciones de péptidos proteotypic como sustitutos para la cuantificación de proteínas en matrices biológicas complejas. Los ensayos tienen varias ventajas en comparación con los inmunoensayos tradicionales. Los reactivos son relativamente menos caros para generar, la especificidad para el analito es excelente, los ensayos pueden ser altamente multiplexado, el enriquecimiento se puede realizar a partir de plasma puro (no requiere el agotamiento), y la técnica se presta a una amplia variedad de proteínas o modificaciones de interés. 8-13 En este video se demuestra el protocolo básico adaptado a una plataforma de cuentas magnéticas.
Protocol
Discussion
El paso más crítico en el protocolo como se describe es asegurar las cuentas siguen siendo bien mezclada durante el período de incubación. Permitiendo que los gránulos se depositan en el fondo del pozo / vial se traducirá en una mayor variabilidad. También es importante para hacer girar hacia abajo el líquido que puede permanecer en la parte superior del pozo / vial tras el período de incubación. Digestión de la tripsina reproducibles también es fundamental. El procedimiento para la digestión descrito aquí se ha utilizado ampliamente en nuestro laboratorio en colaboración con SISCAPA, sin embargo, es probable que los métodos alternos de la digestión puede ser optimizado para un determinado conjunto de proteínas de la meta 15 de elución de los anticuerpos libres no interferir con la detección de la. péptido, probablemente debido a que el anticuerpo se excluye de la columna o eluye más tarde de los péptidos, pero el anticuerpo puede ser reticulado a las perlas de proteína G antes de enriquecimiento de afinidad en los experimentos de gran tamaño o si anticuerpo libre se convierte en un problema. También hemos encontrado que es útil para colocar un imán debajo de la placa de muestra en el muestreador automático, así como el lavado de la columna de la trampa en la dirección opuesta del flujo (en comparación con la carga) para eliminar cualquier residuo granos o partículas. Además de las bolas magnéticas enfoque descrito, la técnica también puede ser adaptado a un formato de columna (es decir, la cromatografía de afinidad). 12, 16
Una vez que el usuario se sienta cómodo con el protocolo general, la técnica también es susceptible de varias modificaciones que mejoran el ensayo general. 11 En primer lugar, es posible analizar múltiples analitos en un único ensayo por la combinación de anticuerpos en la etapa de enriquecimiento (multiplexación por ejemplo). El espectrómetro de masas es capaz de analizar simultáneamente un gran número de analitos. En segundo lugar, aumentar el volumen de la muestra original mejora la sensibilidad de la prueba.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional del Cáncer Clínica Proteómica del Centro de Tecnología de Evaluación (CPTAC) beca (# U24 CA126476), así como una beca de la Industria del Entretenimiento Foundation (EIF) y el Fondo de las Mujeres del FEI de Investigación del Cáncer en el Consorcio el cáncer de mama el descubrimiento de biomarcadores y las generosas donaciones de la Fundación Keck, de la Fundación Canarias, y la Paul G. Allen Family Foundation.
Materials
| Name of the material | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 1000ul Deep well 96-well plates | Eppendorf | 951032786 |
| Oasis HLB 1 cc cartridge plate, Sep-pak, 40 mg 96 well plate | Waters | 186003966 |
| Kingfisher 96 well plate | Thermo Fisher Scientific | 97002540 |
| Clear 96 well, white wall plate | Bio-Rad | HSP9601 |
| Foil cover for 96 well plate | Excelscientific | 12-169 |
| Axymat Sealing mat for 96 well plate | Axygen | 521-01-151 |
| X pierce film | Sigma-Aldrich | Z722502 |
| Kingfisher magnetic bead processor with PCR magnet head | Thermo Fisher Scientific | HSP 9601 |
Table 1: Materials
| Name of the material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Urea | Sigma Aldrich | U6031 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce | 20291 | “no-weigh dithiothreitol” |
| Iodoacetamide (IAM) | Sigma Aldrich | I1149 | |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
| Protein G magnetic beads, 2.8um | Invitrogen | 10004D | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | L5401 | |
| CHAPS | Thermo Fisher Scientific | 28300 | |
| Formic acid | EMD | 11670 | |
| Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific | A998-1 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 242853 |
Table 2: Reagents
| Solution | Comments (optional) |
|---|---|
| 100 mM Tris pH 8 | |
| 9 M urea / 30 mM DTT in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time |
| 500 mM IAM in 100 mM Tris (pH 8) | must be prepared fresh each time |
| Trypsin 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |
| Trypsin inhibitor 1mg/mL in 100 mM Tris pH 8 | |
| Stable isotope standard mastermix | |
| Anti-peptide antibody mastermix |
Table 3: Solutions to be prepared
Referências
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