Quantifizierung von Proteinen über ein Peptid Immunoaffinity Enrichment gekoppelt mit der Massenspektrometrie

Versuchsdurchführung: Der Test erfordert synthetische Peptide und anti-Peptid-Antikörper. Ausgewählte Peptide sollte eindeutig sein, um das Protein von Interesse, enthalten zwischen 8 und 22 Aminosäuren, und haben keine bekannten post-translationale Modifikationen. Methionin-Reste sind in der Regel vermieden und Peptide, die zweibasische Aminosäuren (zB KK, KR, RR) sind unerwünscht. Bei dieser Technik ist es üblich, stabiles Isotop markierten Peptiden als interne Standards zu verwenden, vereinigt Hochleistungs (13 C und 15 N) markierten Aminosäuren in der C-Terminus des Peptids (dh K oder R gekennzeichnet). Das folgende Protokoll beschreibt ein Assay entwickelt, um das Peptid GDSLAYGLR von der Maus-Protein Osteopontin messen, mit anti-Peptid-Antikörper aus Epitomics Inc. (Burlingame, CA) und synthetischer Peptide, die aus New England Peptide (Gardner, MA) erhalten. Das Protokoll besteht aus drei Schritten (Abbildung 1): 1) Trypsin Verdauung der komplexen Proteingemisch, 2) Anreicherung von Peptiden 3) Analyse mittels Massenspektrometrie. Es wird auf einer menschlichen Plasmaprobe mit der Maus Osteopontin Protein versetzt nachgewiesen werden. 1. Trypsin enzymatische Verdauung und Bereinigung Tauwetter 10 ul ordentlich Plasma Aliquot auf nassem Eis. Bestimmen Sie die Gesamt-Protein-Konzentration von BCA-Assay und Zentrifuge die Probe auf eine Entfernung von Schwebstoffen. Pipettieren 10 l Aliquot von seiner Lagerung Rohr zu 1000 ul Deepwell Platte und Cover mit Pierce-fähig Film. Fügen Sie 20 ml frisches 9M Harnstoff / 30mm Dithiothreitol (DTT) (Endkonzentration 6M Harnstoff / 20mm DTT) zu jeder Probe. Inkubieren für 30 Minuten bei 37 ° C. Add 3 ml frisches 500 mM iodoacetamide (final IAM 50 mM) zu jeder Probe. Inkubieren für 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Add 257 ul 100 mM Tris (pH 8) (verwässert Harnstoff auf ~ 0,6 Mio.). Add 10 l Trypsin-Stammlösung (1 ug / ul; für 01.50 Enzym: Substrat-Verhältnis). Inkubieren bei 37 ° C über Nacht (12-16 Stunden). Add 3 ul von tausenden von Ameisensäure (Endkonzentration 1%). Add stabilen Isotopen-Standard (multiple Standards hinzugefügt werden, wenn der Durchführung einer Multiplex-Assays, in der Regel ist dies etwa 10 ul mit 50-100 fmol von Standard-markiertem Peptid). Waschen Sie die Patrone Oasis Platte auch mit 500 ul 0,1% Ameisensäure in 80% Acetonitril, das Verwerfen der Durchströmung. Wiederholen Sie diese 3-fache. Äquilibrieren Sie die Patrone Platte durch Zugabe von 500 ul von 0,1% Ameisensäure in Wasser, und entsorgen Sie die Flow-Through. Wiederholen Sie diese 4-fache. Legen Sie verdauen Proben, um die Patrone Platte und stellen Sie das Vakuum, so dass die Strömung ist sehr langsam. Wash mit 500 ul 0,1% Ameisensäure in Wasser, und entsorgen Sie Flow-Through. Wiederholen Sie diese 3-fache. Eluieren Peptide durch Zugabe von 2 x 500 ul von 0,1% Ameisensäure in 80% Acetonitril in 1000 ul Deep-Well-Platte (nicht verwerfen flow-through). Lyophilisieren (oder Speedvac) das Eluat. (Gefriertrocknung ist die bevorzugte Methode) Rekonstituieren getrockneten Peptide durch Zugabe von 50 ul PBS + 0,03% CHAPS. 2. Peptide Immunaffinitäts Bereicherung Übertragen Sie die Probe auf Standard Kingfisher 96 Well-Platten. Add 1 pg Antikörper und 1,5 ul Protein-G-beschichteten magnetischen Kügelchen pro Ziel (es ist optional an den Antikörper an die Perlen vor der Zugabe zu vernetzen). Stellen Sie sicher, Perlen sind auch durch Schütteln oder Vortexen suspendiert. Die Platte mit Folie. Inkubieren über Nacht (12-16 Stunden) mit sanften Taumeln, um sicherzustellen, Perlen aufgehängt sind. Centrifuge Platte bei 32 xg für 5 Sekunden, um eine Flüssigkeit aus der Folie Oberfläche zu entfernen. Entfernen Sie die Folie abdecken. Waschen und Elution der Perlen kann manuell oder in einer automatisierten Weise durchgeführt werden. Dieses Verfahren beschreibt die Schritte auf einem Kingfisher-Plattform automatisiert. Waschen Sie die Kugeln 2 mal mit 200 ul PBS + 0,03% CHAPS (1 Minute pro Waschgang). Waschen Sie die Kugeln 1 mal mit 200 ul 1:10 Verdünnung des PBS + 0,03% CHAPS (1 Minute). Die Peptide werden in 25 uL von 5% Essigsäure + 0,03% CHAPS eluiert. Setzen Sie den Elutions-Platte auf einem Magneten und Transfer das Eluat einer 96-Well-Platte, die Pflege nicht auf die übrig gebliebenen Perlen zu übertragen. Die Platte mit einem Dichtmatte. Die Platte enthält das Eluat ist auf den dreifachen quadrapole Massenspektrometer für die Analyse geliefert. 3. Die Analyse durch multiple reaction monitoring – Massenspektrometrie Transitions für SRM / MRM Analyse ausgewählt und durch Infusion einer 1 Picogramm pro Mikroliter Lösung von Peptid-Standard in 30% acetonitrile/0.1% Ameisensäure in das Massenspektrometer bei 0,5 ul / min optimiert werden. Sobald stabile Spray erhalten wird, sammelt ein MS / MS-Spektrum. Übergänge sind von der MS / MS-Spektrum durch die Identifizierung thre ausgewählte reichlich Fragment-Ionen in einem Bereich des Spektrums mit wenig Lärm. Für mehrfach geladenen Peptid-Ionen, die y-Ionen-Fragmente bei m / z erkannt> Vorläufer m / z sind in der Regel das Beste für SRM / MRM Assay-Entwicklung. Abbildung 2 zeigt die MS / MS-Spektrum und ausgewählte Übergang Ionen 476,3> 508,3, 579,3 , 692,4 (Übergänge für die schweren stabilen Isotopen Standard 481,3> 518,3, 589,3, 702,4 nicht dargestellt) für das Peptid GDSLAYGLR. Je nach Marke und Modell des Massenspektrometers verwendet, gibt es mehrere Parameter, die für jeden Übergang optimiert werden kann. Hier optimierten wir die Aufprallenergie der jeweils ausgewählten Übergang von Rampen die Aufprallenergie und Überwachung der Pegel des Signals. Eine Kollision Energie von 25 wurde für jeden Übergang verwendet. Kurz gesagt, ist eine typische Konfiguration für SRM / MRM Analyse wie folgt: Mobile Phase (A) 0,1% Ameisensäure, (B) 90% Acetonitril / 0,1% Ameisensäure, 0,3 x 5 mm C18 Trap-Säule, 75 um ID x 15 cm C18 Trennsäule (Reprosil-Pur C18 AQ, 120 A ° Pore). Das Injektionsvolumen beträgt 10 ul und die Probe für 5 min bei 3% B bei einer Gesamt-Volumenstrom geladen 3 ul / min und eluiert mit einem linearen Gradienten von 3 bis 45% B bei 300 bis 400 nL / min in 10 min. Bedingungen auf einem 4000 QTRAP (ABSCIEX, Foster City, CA) wurden spray Spannung 2.3kV, Ionenquelle 150 ° C, GS1 von 12 und Vorhang Gas 15. Die Probe wird durch SRM / MRM durch die Injektion von 10 ul der Probe analysiert. Die Peakflächen sind für leichte und schwere Peptide mit Hilfe des Programms Skyline integriert. 14 Berechnen Sie die Peakflächenverhältnis (PAR) von unmarkiertem / markiertes Peptid in jeder Probe unter Verwendung der am häufigsten vorkommenden Übergang, der frei von Nebengeräuschen ist, in diesem Fall die y5 Übergang (Licht-Peptid 476,3> 579,3, schwere Standard-Peptid 481,3> 589,3). 4. Repräsentative Ergebnisse: Gemessen Peakflächenverhältnisse (light endogenen Peptids gegenüber versetzt schweren Isotopen-markiertes Peptid) liefern ein quantitatives Maß für die Ziel-Peptid. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel-Chromatogramm von leichten und schweren Peptide in einem SISCAPA angereicherten Probe. Beachten Sie, dass leichte und schwere Peptide eluieren gleichzeitig und mehrere Übergänge für jedes Peptid, um die Identität bestätigen können überwacht werden. Abbildung 1. Eine schematische Übersicht über die SISCAPA Prozess. Eine komplexe Proteingemisch wird in Peptide verdaut. Gezielte Peptid Analyten (endogenen Analyten und einer Stachelwalze stabile Isotop-markierten internen Standard) angereichert mit anti-Peptid-Antikörper auf Protein G-beschichteten magnetischen Partikeln immobilisiert. Nach der Isolierung sind die gezielte Peptide, die aus den magnetischen Partikeln eluiert und massenspektrometrisch analysiert zur Quantifizierung in Bezug auf den internen Standard. Abbildung 2. MS / MS-Spektrum des Peptids GDSLAYGLR zeigt Auswahl von drei Fragmente für SRM / MRM-Übergänge. Abbildung 3. Beispiel Chromatogramme zeigen die Peak-Profil eines Licht-Peptid Analyten (rot) und der schweren stabilen Isotopen-markierten internen Standard (blau). Chromatogramme für die y5 Übergang von der Licht-Peptid (476,3> 579,3) und schwere stabile Isotop markiert Standard (481,3> 589,3) sind über der Zeit aufgetragen, wie sie aus der Chromatographie-System zu eluieren.