Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

1. Kuş embriyo CAM içine tümör Aşılama Kabuk az döllenmiş tavuk embriyolar 8 açıklandığı gibi hazırlayın. Embriyonik gelişim Gün 9, 1 ml şırınga üzerine bağlı 18-gauge iğne kullanılarak bir mikro enjektör montajı. 5-6 inç Tygon boru (1 / 32 "iç çapı, 3 / 32" dış çapı, 1 / 32 "duvar kalınlığı) bir parça kesin ve tüp içine iğne konik dikkatlice yerleştirin. Tüp yaklaşık 4-5 cm iğne ucu kadar uzanır (Şekil 1a). Hücre süspansiyonu ile şırınga ve tüp doldurun. Daha sonra, boru sonunda mikroenjeksiyon cam iğne takın ve dikkatli bir şekilde herhangi bir hava kabarcıkları. Gün ışığı ile CAM (Şekil 1c) içinde bolus olarak 10,000-100,000 kanser hücreleri bir diseksiyon kapsamında 9 embriyolar (Şekil 1b) enjekte edilir. Hücreleri enjekte yavaş yavaş ve dikkatli bir iğne CAM içinde görünür bir bolus oluşturmak için hücreleri için doğru yerde olduğundan emin olun. Hücreler CAM yüzeye damla Kimwipe veya diğer aplikatör kullanılarak temizlenebilir. % 60 nem ve 38 ° C'de nemlendirilmiş inkübatör embriyo dönün ve tümör izin büyümeye ve vascularize (7 güne kadar). 2. Nanoparçacıkların hazırlanması Tavuk embriyo içine enjeksiyon için floresan etiketli CPMV nanopartiküller hazırlamak için; viral nanopartiküller (herhangi kaldırmak için kullanarak ve bir dakika boyunca santrifüj önce 100 mg / ml Vortex karışımı bir konsantrasyon, PBS, pH 7.4 8 olarak sentezlenmiş sulandırmak toplar. Sonikasyon konjugatları ve agregasyon derecesi bağlı olarak yararlı olabilir 4 saklandığında floresan etiketli CPMVs stokları en az 1 yıl boyunca stabildir ° C karanlıkta bir çift koyarak stokları periyodik olarak kontrol edin bir cam slayt üzerine düşer ve floresan kontrol Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) parçacıklar konjugasyon sonra değişmediğini belirlemek için kullanılır. Kısaca, viral nanoparçacıkların bir mikrogram (2 ul nihai hacmi) bakır kaplı ızgaraları eklenebilir. Sonra, bir eşit miktarda elektron mikroskobu (Philips EM 410) az 1 dakika süreyle% 2 oranında uranil asetat ekleyin. 3. Floresan etiketli viral nanoparçacıkların İntravenöz enjeksiyon 16 Gün, yukarıda açıklandığı gibi mikro enjektör montajı. Şırıngaya boru (> 200 mcL) ile viral nanoparçacık istenilen hacmi çizin. Herhangi bir hava kabarcığı dikkatlice çıkarın. Mikroenjeksiyon cam boru sonunda iğne takın. Iğne kadar uzun ve mümkün olduğunca konik (Şekil 2a) olduğundan emin olun. Iğne çok künt ise, ektoderm ile delmek için mümkün olmayacaktır ve gemi nüfuz başarısız olur. Iğne çok keskin ise doku nüfuz ederken, ucu çökecek. İstediğiniz siteye distal tümör taşıyan embriyo haline intravenöz (Şekil 3d) görüntülenebilmekte 1 mg / ml flöresein dekstran (MW 70.000 Da, Invitrogen) 100 ul enjekte edilir. Başarılı CAM ven kanülasyonu enjeksiyon akış yolu kan temizleme (Şekil 2b) tarafından açıktır. Enjeksiyon sonrası vasküler sızıntı 1 saat değerlendirin. İstediğiniz siteye distal vasküler sızıntı tümörleri içeren embriyolar halinde intravenöz CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-AF 647) veya pegile CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) 1 mg / ml solüsyon enjekte 50 ul görüntülenebilmekte. Görüntü hemen tümörler ve enjeksiyondan sonra bir Yokogawa dönen disk, Hamamatsu ImagEM 9100-12 EM-CCD kamera ile donatılmış bir Zeiss Examiner Z1 dik bir mikroskop kullanılarak her saat. 4. Gerçek zamanlı intravital görüntüleme Embriyo görüntüleme birimi bir araya getirmek için, vakum gres embriyo görüntüleme ünitesi kapağın alt görüntüleme liman çevresinde ince bir tabaka halinde uygulayın ve liman üzerine 18 mm cam lamel uyacak. Lamel görüntüleme için istediğiniz alanı kapsayacak böyle embriyo yerleştirin. Lamel yavaşça embriyo ile temas edinceye kadar kapağı düşük ve daha sonra birim üzerine kapağı vidalı bir yerde tutun (Şekil 2c). Embriyo içeren çanak dışında embriyo görüntüleme ünitesi içine 37 ° C sıcak su ekleyin ve sonra 37 dengelenmiş içinde çevre odasına ° C ile dik bir konfokal mikroskop sahneye tüm birim İplik disk konfokal floresan mikroskobu (Şekil 2e) altında embriyo içeren Pozisyon görüntüleme ünitesi. Görüntüleme ünitesi yakalanan üç boyutlu Z yığınları ve zaman atlamalı görüntüleri için izin, yer embriyo tutun ve görüş alanı yakalama görüntüleri ise sabit tutmak. Biz kazanmak ve Perkin Elmer (eski Doğaçlama) Volocity yazılım paketi (Şekil 3a) kullanarak üç boyutlu zaman atlamalı görüntüleri analiz. Tümörün üç boyutlu bir yığın yüksek çözünürlüklü ve detaile görselleştirmek için çevreleyen damar kazanmakd belirli bir zaman noktalarında yapısal analizler. Tümör damarsal ayrıntılı yapısal değişiklikler eşlemek için normal süre noktaları üç boyutlu yığınlar edinin. Görüntü tümörler her enjeksiyondan sonra saat. Hesaplayarak ortalama Alexa Fluor (AF), tümör ya da böyle bir Volocity olarak stroma (non-tümör alan) kullanarak görüntü kantitatif yazılımı (Perkin Elmer) seçilen bölgeler içinde 647 sinyal alımını viral nanoparçacıkların Asitli. Stroma oranı tümör stroma ortalama AF 647 sinyal üzerinde tümörün ortalama AF 647 sinyal bölünmesi ile hesaplandı. Tümör / stroma oranı 1'den yüksek bir nanoparçacık tümörün alındığını olduğunu gösterir. 5. Temsilcisi sonuçları: Örneğin burada anlatılan, biz günde 9 tavuk embriyolar (Şekil 1b) CAM içinde yaklaşık 1 mm boyutunda bir bolus oluşturmak için HT-29 kolon kanseri hücreleri enjekte etti. Aşılama sonra, embriyolar yeterli tümör büyümesi ve vaskülarizasyon (Şekil 1c) izin nemlendirilmiş bir inkübatör 7 gün süreyle kültüre edildi. Embriyolar tümör vaskülarizasyon onaylamak düşük molekül ağırlıklı dekstran ile intravenöz enjekte edildi ve tümörler Zeiss AxioExaminer Z1 dik mikroskobu (Şekil 2d) altında görüntülendi. CPMV-AF 647 veya CPMV-PEG-AF 647 nanopartiküller intravenöz uygulamadan sonra (Şekil 3a ve b), yüksek çözünürlükte gerçek zamanlı konfokal görüntüleme (Şekil 2e) CPMV ve CPMV-PEG hızla tüm damarsal etiketli nanopartiküller saptandı, ancak tümör CPMV-PEG alımı (Şekil 3a) 12 saat sonra, CPMV daha yaklaşık 3 kat daha yüksek oldu. Nanoparçacıkların nispi tümör alımı, görüntü analiz yazılımı (Perkin Elmer Volocity) kullanılarak tespit edildi. Tümör içinde ve dışında ilgi Bölgeler seçildi (stromal bölmesi) ve her birinin ortalama floresan yoğunluğu tespit edilmiştir. Veri tümör / stroma oranı olarak ifade edilir. Şekil 1 bir kuş embriyo CAM içine tümörlerin Mikroenjeksiyon. Belirtildiği gibi (a) mikroenjeksiyon cihaz bileşenleri bir araya. (B) 9 gün Kuş embriyolar CAM tüm yüzeyini kapsayacak şekilde yayıldı tümör ile aşılanmış olmak için hazırız. (C) 16 gün, tümör çapı 1 cm (kesikli çizgi) kadar büyüdü ve nanopartiküller ile enjeksiyon için hazır olacak. Şekil 2 Nanopartikül enjeksiyon ve intravital görüntüleme. Gösteren bir diseksiyon mikroskop altında enjeksiyon (a), (temizleyerek görülen CAM damar içine enjekte edilir ve (b) mikroenjektör iğne kan akımı enjekte nanopartiküller damar içine eklenir (ok ile gösterilir) ve hazır mikroenjektör iğne ucu kan). (C) Görüntüleme birimi lamel CAM ile doğrudan arabirim ile kuş embriyo içeren. (D) nanoparçacık enjeksiyon öncesinde, tümör vaskülarizasyon floresein dekstran enjeksiyondan sonra intravital görüntüleme ile değerlendirildi. (E) Görüntüleme Ünitesi, 37 ° C sıcaklığa ayarlı muhafaza kümesi içinde dik bir konfokal mikroskop sahnede yer embriyo içeren Şekil 3 insan tümörlerinde nanoparçacık alımı intravital görselleştirme. Tümörler (a) CPMV-AF647, (b) CPMV-PEG-AF647 enjeksiyonundan 7 saat sonra görüntülenir. d) sonraki analiz için kuş embriyo tümör eksizyonu.