Визуализация интерстициальные клетки Кахала (МУС) в сети Мыши
Summary
Интерстициальные клетки Кахала (МУС) кардиостимулятора клетках желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Они образуют сложные сети между клеток гладкой мускулатуры и пост-ганглиозные нейронные волокна регулировать И. сократительной. Здесь мы представляем методы иммунофлюоресценции поперечного сечения и целые монтажа визуализации мышиной сетей МУС.
Abstract
Интерстициальные клетки Кахала (МУС) мезенхимальных производных "кардиостимулятор клетки" из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), которые генерируют спонтанное медленные волны, необходимые для перистальтику и посредником нейронов участии кишечной нервной системы1. Различные подтипы МТП форме различных сетей в мышечной из желудочно-кишечного тракта 2,3. Потеря или повреждение этих сетей связан с рядом нарушений моторики 4. ICC клетки экспрессируют КИТ тирозинкиназы рецепторов на мембране плазмы и КИТ иммуноокрашивания был использован в течение последних 15 лет, чтобы этикетка МТП сети 5,6. Важно отметить, что нормальная деятельность КИТ требуется для развития МТП 5,6. Онкологические преобразования МТП клеток приводит к желудочно-кишечного стромальных опухолей (GIST), что зачастую гавани получить-функции КИТ мутации 7,8. Недавно мы показали, что ETV1 является линия-специфической выживаемости фактор выражается в линии ICC / GIST и мастер транскрипционного регулятора необходимо как для нормального формирования сети МТП и в GIST опухолей 9. Мы также продемонстрировать, что она сотрудничает с активацией КИТ мутации в опухолей. Здесь мы опишем методы визуализации сети МТП на мышах, в значительной степени основаны на ранее опубликованных протоколов 10,11. Совсем недавно, хлорида канал anoctamin 1 (ANO1) также был охарактеризован как специфическим маркером оболочки МТП 11,12. Из-за их локализации мембраны плазмы, иммунофлюоресценции обоих белков могут быть использованы для визуализации МТП сетей. Здесь мы описываем визуализации сети МУС фиксированной замороженных cyrosections и целом подготовка монтирования.
Protocol
Discussion
Интерстициальные клетки Кахала были изначально характеризуется Сантьяго Ramóón Кахаль ровно сто лет назад использованием метиленового синего и хромата серебра пятна желудочно-кишечного мышечной. Кахала первоначально думали МУС были нейронов на основе их процессами, которые напоминают аксонов и дендритов. В течение многих последующих лет, изучение биологии МТП было ограничено из-за отсутствия специфических маркеров до открытия, что КИТ не только выражается в МУС, но и необходимые для их развития 6. С тех пор, КИТ иммунофлюоресценции широко используется при исследовании МТП биологии и привело также к оценке Международной торговой палаты в других сократительной органов, таких как мочевой пузырь. В последнее время ANO1 была определена в качестве второго надежным маркером МУС.
Там были многочисленные публикации в течение последних 15 лет с помощью иммунофлюоресценции для выявления ICC с помощью различных фиксации и монтаж техники. В наших руках "фиксированных замороженных" cryosections, которые были с префиксом параформальдегида и сахарозы защищены работает лучше по сравнению с ацетоном или параформальдегид после фиксации после cryosectioning. Для тотальных, мы обнаружили, что ацетон фиксации затем слизистой рассечение дает наиболее надежные результаты.
Исторически сложилось так, ACK-2 был комплект антител выбора для мыши МТП идентификации. Это крысиного моноклонального, которая признает внеклеточный домен, и это также блокирование антителом, которое вызывает кишечная непроходимость, когда оно сделано живых мышей. Тем не менее, ACK-2 эпитопа медленно уничтожены параформальдегида фиксации и не спасли с помощью стандартных методов поиска антигена. Мы обнаружили, что ACK-4 эпитопа более устойчив к параформальдегида фиксации. По сравнению с фиксированными замороженных блоков и секций, парафин блоков и секций сохраняет морфологию лучше и более пригодными для долгосрочного архивирования (рис. 4). Ни ACK-2, ни ACK-4 были успешно использованы в парафиновых срезах. Мы охарактеризовали что D13A2, новые кролика моноклональное антитело, работает исключительно хорошо в обоих фиксированных замороженных и парафиновых срезов желудочно-кишечного тракта.
Комплект выражается и в некоторых других типах клеток, в том числе меланоциты, кроветворные клетки, половых клеток, в частности, тучных клеток, которые также найдены в желудочно-кишечном тракте. К счастью, большинство тучных клеток находятся в слизистой оболочке, а не в мышечной. Двойное окрашивание кролика против Ano1 и крысы анти-Kit можно устранить без специфического окрашивания каждого антител (рис. 4). Стоит также отметить, что относительное выражение Kit и Ano1 между подклассами МУС выглядит иначе. Например, в тонкой кишке, Кит окрашивания значительно интенсивнее в myenteric ICC по сравнению с МТП глубоких мышц сплетения в то время как Ano1 окрашивания является сопоставимым.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Национального института рака (K08CA140946, чтобы YC), (5F32CA130372, на ПК), (R01CA102774 и R01HL055748 П. Б.), Министерства обороны (PC094302 к YC), Фонда Шумана Семья для ГИСТ исследований (на PC), и Консорциум Старр рака (к ПК, ЖК, CLS и ПБ). Мы хотели бы поблагодарить Катю Манова, Ning вентилятора, и Mesurh Turkekul из MSKCC молекулярной объекта основных цитологии за помощь в cryosectioning и иммунной окраски.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-2) | eBioscience | 14-1172 | Use at 2μg/ml. Epitope is lost with overfixation. |
| rat anti-Kit antibody (clone ACK-4) | Cedarlane | CL8936AP | Use at 2μg/ml. |
| rabbit anti-KIT antibody (clone D13A2) | Cell Signaling | 3074 | Use at 1:100 dilution. Only antibody listed here that works well in paraffin sections. |
| rabbit anti-Pgp9.5 antibody | Abcam | ab10404 | Labels neuronal cell cytoplasm. Useful for marking neurons of the myenteric plexus. Use at 1:1000 dilution. |
| rabbit anti-Ano1 antibody | Abcam | ab53212 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rat IgG | Invitrogen | A-11007 | Use at 2μg/ml |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11008 | Use at 2μg/ml |
| Animal Feeding Needle | Fisher | 01-208-87 | Silicon tipped needle useful for flushing GI tract of adult mice |
| Blunt Needle | Becton Dickison | 305180 | Blunt needle useful for flushing GI tract of pre-weaned pups |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | May use alternative hard-setting mounting media with DAPI |
| Tissue-Tek Cryomold | Tissue-Tek | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Tissue-Tek | 4583 | |
| 32% Paraformaldehyde (10ml sealed ampoule) | EM Sciences | 15714 | Open sealed ampoule and dilute to 4% just before use |
| Blocking buffer | 5% Goat serum, 0.1% Triton X-100 in PBS |
Referências
- Sanders, K. M. A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 111, 492-515 (1996).
- Ward, S. M., Sanders, K. M. Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal: from bench to bedside. I. Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281, 602-611 (2001).
- Komuro, T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. J Physiol. 576, 653-658 (2006).
- Sanders, K. M., Ordog, T., Koh, S. D., Torihashi, S., Ward, S. M. Development and plasticity of interstitial cells of Cajal. Neurogastroenterol Motil. 11, 311-338 (1999).
- Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine. J Physiol. 480, 91-97 (1994).
- Huizinga, J. D. W/kit gene required for interstitial cells of Cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 373, 347-349 (1995).
- Rubin, B. P., Heinrich, M. C., Corless, C. L. Gastrointestinal stromal tumour. Lancet. 369, 1731-1741 (2007).
- Hirota, S. Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science. 279, 577-580 (1998).
- Chi, P. ETV1 is a lineage-specific survival factor in Gastrointestinal Stromal Tumour (GIST). Nature. , (2010).
- Kwon, J. G. Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors. Gastroenterology. 136, 630-639 (2009).
- Hwang, S. J. Expression of anoctamin 1/TMEM16A by interstitial cells of Cajal is fundamental for slow wave activity in gastrointestinal muscles. J Physiol. 587, 4887-4904 (2009).
- Gomez-Pinilla, P. J. Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1370-G1381 (2009).
- Sommer, G. Gastrointestinal stromal tumors in a mouse model by targeted mutation of the Kit receptor tyrosine kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6706-6711 (2003).
