Génération et d'étiquetage des murins de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées des nanocristaux Qdot pour les études de suivi

1. Dissection de fémurs et tibias de la souris et la culture de cellules de moelle osseuse Sacrifice 2 souris par le CO 2 asphyxie et soigneusement décortiquer les tibias et les fémurs sans couper les extrémités des os. Nettoyez les os de tous les tissus attachés en utilisant du papier de soie. Attention à ne pas briser les os. Stériliser les os par immersion dans de l'éthanol à 70% pendant 10 min dans un plat de Pétri de 35 mm. A partir de ce moment, le travail intérieur d'une hotte de biosécurité pour éviter la contamination des cultures cellulaires. Récupérer les os de l'éthanol et les laisser sécher à l'air pendant 5 min dans une boîte de Pétri dans l'armoire de biosécurité. Couper les fémurs de moitié, et le tibia par sa pointe plus fine. Faire infuser l'intérieur de l'os avec 1 ml de milieu RPMI (sans sérum mais avec des antibiotiques) à l'aide d'une seringue stérile sur une boîte de Pétri stérile. La suspension cellulaire est recueilli et lavé 2X dans le milieu RPMI par 10 centrifugation min dans un tube de 15 ml de centrifugeuses à 1100 RPM dans une centrifugeuse réfrigérée (4 ° C) avec un rotor swing. Après le dernier lavage, remettre en suspension les cellules dans 2 ml de tampon de lyse ACK et incuber pendant 5 min à température ambiante afin d'éliminer les globules rouges. Ajouter 13 ml de RPMI avec 10% de FBS, resuspendre et laver 2X dans ce milieu avec les mêmes paramètres que décrite au point 1.6. Compter les cellules, ajuster à 2 x 10 5 cellules / ml avec du RPMI 10% SVF, et ajoutez rm-GM-CSF (20 ng / ml final) 5. Ajouter 10 ml de cette suspension à une stérile, la qualité microbiologique, 10 cm boîte de Petri, et la culture dans un incubateur à CO 2 (37 ° C, 5% CO 2). Trois jours plus tard, ajouter un autre 10 ml de RPMI 10% SVF à 20 ng / l de rmGM-CSF à chacun des plats préparés. Trois jours plus tard, 10 ml de suspension cellulaire sont récupérés à partir de chaque boîte de Pétri, centrifugé comme dans 1.6, remis en suspension dans le même volume de RPMI 10% SVF avec rmGM-CSF et retourné à la boîte de Pétri. Les cellules sont cultivées pendant 2 jours supplémentaires dans l'incubateur CO 2. 2. Collecte et l'étiquetage des PED Après 8 jours de culture des cellules faiblement adhérentes sont récupérées par lavage de la boîte de Pétri avec un milieu frais. Ce protocole rend environ 2-4 x10 8 PED dans nos mains. Les cellules peuvent être analysés pour phénotype DC par cytométrie en flux. Cellules prélevées sont ensuite étiquetées avec le Qtracker 655 Kit marquage cellulaire suivant strictement les instructions du fabricant. Nous avons obtenu d'excellents résultats étiquetage dérivées de la moelle osseuse de souris avec les PED Qdots à une concentration de 10 nM. Pour ce faire, des aliquotes de composants cellulaires Kit Qtracker Etiquetage A et B sont mélangés dans des volumes égaux, incubé pendant 5 min à température ambiante, et immédiatement après dilution 1 / 100 en milieu frais avec vortex pendant 30 s. Pour tache 5 x 10 6 CD, mélanger 5 ul de chaque composants du kit A et B dans un tube Eppendorf et incuber pendant 5 min à température ambiante. Ensuite, ajoutez 1 ml de RPMI FBS incuber 10%, et le vortex pendant 30 secondes. Ajouter 0,5 ml de suspension cellulaire contenant 5 x10 6 CD, et incuber à 37 ° C pendant 60 min. Ensuite, laver les cellules 2X dans RPMI 10% SVF (1100 RPM). Les cellules peuvent être remises en suspension dans du RPMI pour la culture d'autres ou en PBS pour injection dans des souris expérimentales. 3. Evaluation de DC étiquetés Marquage cellulaire peut être évaluée au moyen de la microscopie à fluorescence. Pour ce faire, une goutte de suspension cellulaire sont ajoutés à une lame de microscope, recouvert d'une lamelle de verre, et évaluées avec un microscope à fluorescence en tenant compte que ces Qdots ont émission et d'excitation des spectres de 565nm et 525nm, respectivement de 405 (fig. 3 ) À ce stade, les cellules marquées peuvent être utilisées pour injecter des animaux, ou de maturation peut être induite en incubant ces cellules pendant 48 h (37 ° C, 5 CO 2), en présence de LPS (100 ng / ml) et le TNF-( 20 ng / ml). Fluorescent étiquetage n'est pas affectée par la maturation des CD (fig. 4). 4. Les résultats représentatifs: Par la présente, nous avons décrit comment préparer dérivées de la moelle osseuse de souris et comment les PED étiquetés avec Qdots fluorescentes. Fig. 1 résume la procédure pour obtenir la cellule, tandis que la Fig. 2 illustre la procédure à les étiqueter avec Qdots. Comme le montre la Fig. 3, presque toutes les cellules sont marquées par cette procédure, et ce n'est pas affectée par la maturation des CD avec des facteurs inflammatoires (Fig. 4). Fig. 5 montre que Qdot teinté PED (Fig.5a) se comportent similaires aux non-tachés cellules lorsqu'elles sont traitées avec un cocktail inflammatoires. Les deux préparations cellulaires de la même réguler positivement l'expression des molécules de costimulation (Fig. 5b), et de produire des quantités similaires de l'IL-6 (fig. 5c) et l'oxyde nitrique (fig. 5d) à des stimuli de maturation. Ceci concorde avec précédes unités d'organisation des données publiées indiquant que la coloration Qdot n'affecte pas la capacité de DC à se transformer en cellules matures capables de provoquer des réponses immunitaires [6]. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées pour injecter des animaux de laboratoire. Comme le montre la Fig. 6, 2 jours après l'injection intraveineuse de PED étiquetés dans des souris, nous avons été capables de détecter Qdot cellules colorées dans la rate. Ceci est également en accord avec les précédents données publiées montrant l'utilisation des nanocristaux Qdot pour évaluer la migration des DC in vivo [6] par l'imagerie non invasive et cytométrie de flux. Organigramme Figure 1. Génération du CC de la moelle osseuse. Par la présente, nous dépeignent le processus pour obtenir la moelle osseuse DC dérivées. Les deux tibias et les fémurs sont disséqués et propre à partir de tissus environnants. Conseils osseuse sont préservées et l'intérieur de l'os sont rincées avec support. Après l'élimination des globules rouges, cellules de moelle osseuse sont cultivés pendant 8 jours en présence de GM-CSF pour les différencier en DC. Organigramme Figure 2. De la procédure d'étiquetage. Aliquotes égales des composants de la cellule Kit Qtracker Etiquetage A et B sont mélangés dans un tube Eppendorf. Les cellules dendritiques sont collectées à partir de 8 jours cultures de moelle osseuse avec GM-CSF et mélangé avec le colorant d'étiquetage pour 60 min à 37C. Puis les cellules sont lavées dans les médias afin d'éliminer les particules d'étiquetage excès. Figure 3. Microphotographie fluorescent des PED immédiatement après l'étiquetage. Une goutte de cellules marquées a été déposé sur une lame de verre et couverts par une lamelle. Ensuite, des échantillons ont été évalués dans un microscope à fluorescence et images ont été acquises par une caméra numérique 5.0 Micropublisher CCD couleur (QImaging, Surrey, BC Canada). Figure 4. Microphotographie fluorescent des PED après 48 h de maturation in vitro. PED étiquetés ont été cultivés pendant 48 h avec le LPS (100 ng / ml) et le TNF-α (20 ng / ml) sur des lames de verre sur un incubateur à CO 2 (37 ° C, 5% CO 2). Ensuite, des échantillons ont été lavés avec du PBS (5 min, 2X), fixées à l'acétone (15 min, 4 ° C) et de contraste avec le DAPI. Les cellules ont été évaluées dans un microscope à fluorescence comme ci-dessus. Figure 5. L'activité biologique des Qdot teinté CD matures. PED étiquetés mûri in vitro, comme ci-dessus ont été analysés par cytométrie en flux (A) et (B). (A) Qdot cellules colorées donner un signal fort dans le FL3 (PerCP) canal. Shaded histogramme: contrôle non colorées. (B) PED Qdot-colorées et non colorées ont en outre été colorés avec des anticorps spécifiques contre la maturation des marqueurs CD86 et CD40, et contrôle isotypique. Les cellules ont ensuite été analysées dans un cytomètre en flux FACSort (Becton Dickinson, San Jose, CA). De plus, l'IL-6 (C) et l'oxyde nitrique (NO) ont été déterminés dans les surnageants de maturité Qdot teinté PED et les contrôles. Les niveaux d'IL-6 et de l'oxyde nitrique ont été déterminés par analyse ELISA et test de Griess que nous avons décrit précédemment 7, 8. Toutes les données ont montré dans cette figure est représentative de deux ou trois expériences indépendantes montrant des résultats similaires. Les données ont été analysées par ANOVA en utilisant le logiciel GraphPad. Figure 6. Détection des PED dans les tissus étiquetés disséqués. Étiquetés CD matures (1×10 6 cellules) ont été injectés par voie intraveineuse à des souris C57BL / 6. (A) Deux jours plus tard, les souris ont été sacrifiées et les rates recueillies, snap congelés, embarqué dans un PTOM, et 8 sections uM préparés en utilisant un cryostat. Ensuite, des échantillons ont été fixés avec de l'acétone (15 min, 4 ° C) et de contraste avec le DAPI. Les cellules ont été évaluées dans un microscope à fluorescence comme ci-dessus figure 6a:. Grossissement de 40X, fig 6b: grossissement 100X, fig. 6C, grossissement 400x.