初代ヒト卵管上皮細胞のex vivoでの文化

1。コラーゲンの準備とフィルターコーティング。 ヒト胎盤コラーゲンを準備するには、ヒト胎盤コラーゲン30mgのをピンセットで抜くと攪拌棒を500 mlのビーカーに50mlの蒸留水（のdH 2 O）の上に置く。 それは容易に溶解するように直接コラーゲンに氷酢酸100μlsを追加。 37℃程度まで加温し、コラーゲンを溶解するために、それをかき混ぜる。それは20〜30分で溶解してください。コラーゲン鎖が溶液中に残っている場合は、フィルター滅菌が困難になります。 のdH 2 Oを450 mlと50 mlのストックを希釈し、0.2μmメンブレンでろ過滅菌します。これは最終的な実用的なソリューションです。 4℃で保存します。 コー​​ティングその晩コラーゲン（50〜100μl）を持つことによってトランスウェルフィルター膜を準備します。チルドコラーゲンをRTに温め、次いで一晩、室温でメンブレンをカバーするために、上部コンパートメントに追加する必要があります。トランスウェルフィルター上に解離主卵管（FT）上皮（下記参照）をメッキする前に、1Xリン酸塩で三回は過剰なコラーゲンを除去するために使用前に生理食塩水（PBS）少なくとも1時間をバッファリングのフィルターを洗う。 2。組織の収集と解離。 新鮮な卵管（FT）采を50 ml遠心チューブに滅菌1X PBSで回収し、無菌組織培養フードに処理を要求する前に氷上で保存する。 （サンプルはメディアの別のタイプに収集されたか、これはメッキの効率を妨げる可能性があるので、できるだけ多くの血液と外国メディアを取り除くために、少なくとも3倍血の洗浄であるとされている場合）1X PBSを冷やして一回20ml中の組織サンプルを洗浄してください。 滅菌メスと滅菌ピンセットを使用して、少しPBSと10 cmの組織培養皿に滅菌ピンセット転送FTを用いて、上皮細胞の露出を最大化するために縦にカット。それはもはやチューブが、組織のほぼ平らなシートがないように采を開きます。その後小さいが、それでも回収可能部分（直径約3 mm）に切断。 50 mlチューブにチルド解離メディア45mlの（1.4 mg / mlのプロナーゼとは0.1 mg / mlのDNaseを含むMEM）に曲を転送する。 4 24〜72時間℃で穏やかに揺らし。 （経験から、48時間が最適です）。解離の量を確認するには、スライド上に解離メディアのドロップを入れて、凝集と組織の生存率（繊毛細胞を破って）の量を確認してください。あなたは、単一細胞といくつかの小さな塊の両方を見てみたい。 3。卵管のメッキ。 上皮細胞の解離の量が最適であるときは、FBSの10％のボリュームを追加することにより、メディアを不活性化する。小さな凝集体に細胞懸濁液を取り除くために、数回転倒混和します。 底部にチューブを解決するために大規模な組織の塊（間質組織を）許可する。第二50 mlチューブに上皮細胞を含むメディアを取り外します。 オリジナルの50 mlチューブに冷たいMEMを50ml（無FBS）を追加します。追加の細胞を収集するために反転。第三50 mlチューブ（サンプルが非常に大きく、細胞の高い数値が期待されている場合、このステップは、セルのコレクションを最大化するために繰り返すことができる）にメディアを収集する。間質/細胞外組織の大部分は破棄することができます。これで、細胞懸濁液の2個の50 mlチューブを持っている。細胞ペレットから5分、吸引解離のメディアのための1000 rpmで遠心。 USG培地（DMEM：F12 2パーセントUSGと1％ペン連鎖球菌を補充）の約5-10 mlに再懸濁し、37℃に温めピペット。これは上皮細胞を損傷し、文化の質を低下させる可能性があるため、あまりにも積極的にピペッティングしないように注意してください。単一細胞と小さな塊（図1）があるはずです。 1時間または最大3時間以上Primaria培養皿とインキュベートへ転送。線維芽細胞と赤血球は、プラスチックに付着しますが、FT上皮細胞はしません。何かが付着しているかどうかを確認する時間後にプレートを見てみましょう。繊毛細胞の存在は、繊毛の拍動に注目することによって見ることができます。 このインキュベーションの間、コラーゲンコートされたフィルターを洗浄し、細胞播種の準備ができたことができます（ステップ1.4参照） Primariaプレート上のインキュベーションの1-3時間後、15 mlのチューブに細胞懸濁液を転送し、5ml USGメディアとPrimariaプレートをすすぎ、15 mlの最終容量を作るためにチューブにこのメディアを転送する。 5分間1000rpmで遠心する。 慎重に培地を吸引除去し、細胞ペレットを中断することは避けてください。ペレットの大きさから判断すると、USGメディアの適切な量で再懸濁します。あなたがする必要がある場合はさらに希釈できるように（通常1〜3ミリリットルの間で）以下は、初めに優れています。静かに懸濁します。 血球計算盤に再懸濁した細胞を10μlを加え、細胞密度を決定する。ヒント：あなたは明らかに暗い細胞膜を持つと非柱状である上皮細胞を探している。また、確実に移動している繊毛細胞を数えることができます。ハローappearanを持つ小さな細胞ceは赤血球であり、カウントすべきではない。これは一種の塊であるので、その使用電池数内に見積るため必要となります。種まきのターゲットは1.65 × 10 5細胞/細胞膜、または少なくとも75％フィルターカバー（図1）です。細胞があまりにもまばらに播種されている場合、細胞は完全に上皮層を形成することができなくなります。 24ウェルプレートのウェルの底にUSGメディア500μlを加え、トランスウェルを挿入します。 FTの細胞懸濁液（上記参照）の必要量は、それぞれのメンブレン上に加えることができる、これは通常100μlである。 膜の上部を乱すことなくインキュベートし、1〜2日のために成長する。必要に応じて、それらの日の間に基底側にあるメディアを変更することができます。 1〜2日後に、慎重にUSGのメディアでトップを洗浄し、膜の上に小容量のリムーバブルメディア（50〜100μl）を追加することができます。それはメディアが顕微鏡の前にフィルタの頂端側から削除されている場合、細胞培養の合流を決定する方が簡単です。下部コンパートメントには、常にメディアが含まれている必要があります。かつての文化が（通常5日以内に）完全にコンフルエントな、頂辺に基底からフィルタを通って移動するメディアの量は無視できるはずです。 最初の10日間の2日に1回基礎培地を変更します。下部コンパートメントには、常に細胞が生き続けるためにメディアを持っている必要があります。いったん細胞は、それらがそのような免疫蛍光（IF）または免疫組織化学（IHC）のようなさらなる研究、に使用することができる（図1と図2）タイト上皮層を形成している。 4。膜処理。 膜処理が実行される試験の種類に依存しますが、通常はトランスウェルインサートからフィルタの除去を含む。 フィルタは、典型的に除去する前の1X PBSを200μlで3回洗浄する。 フィルターの先端と基底側からPBSを吸引除去する。これは、乾燥から膜を防ぐために、一度に1ウェルを行う必要があります。 、プレートからカバーを取り外し、それを上下逆さまに反転し、膜の周りにカットする滅菌メスを使用してください。代わりに、エッジの周りにメスをドラッグすると、膜のエッジの周りストレートカットすることによって、一枚の膜を除去するようにしてください。 細胞が上にあるどちら側を追跡する、インサートからフィルタを削除するには、ピンセットを使用してください。フィルタは、必要に応じてIF、IHC、等のために処理することができます。 例：試験は、フィルターが（適切な抗体との固定、透過処理、ブロッキングやインキュベーションの後、手続きIF規格に準拠）スライド上に配置する必要がある場合のために、DAPIで、Vectashieldを上向きにし、細胞をフィルター上に滴下さとで覆われてガラスカバースリップ。 5。代表的な結果： トランスウェルフィルターは、容易に免疫組織化学（IHC）と免疫蛍光（IF）の両方でex vivoでの上皮を調べるために削除することができます。特異的なマーカーリネージュ使用して、一つはイメージできると分泌（正Pax8）及びこれらの培養物における繊毛（Sall2ポジティブ）細胞区画（図3）を定量化する。また、これらのマーカーを使用して、一つは各セルのタイプは異なる生理的な手がかりを10に応答する方法を監視することができます。このシステムは、様々な刺激に反応してFTの上皮のsecretomeと細胞内リン酸化プロテオームの変化を特徴付けるために使用されています。 図1。イラストは 、ex vivoでの培養は、初代ヒト卵管組織から生成される方法を描いた。卵管線毛組織が ​​手術室から取得し、24〜72時間2の解離メディアで洗浄し、インキュベートする小さな断片1を生成するためにみじん切りされています。解離が完了した後、組織片は培養管の底に沈降させていると解離上皮細胞を含む培地3を収穫される。解離の効率は、位相差顕微鏡4の下検査によって監視することができます。解離上皮細胞は、線維芽細胞と常に上皮細胞5で混合した造血細胞を除去するためにPrimariaプレート上で培養されています。非上皮細胞が十分除去されると、上皮細胞はヒト胎盤コラーゲン5で被覆されているトランスウェルフィルター上に接種されています。メディアは以下のトランスウェルを介して拡散によって提供されます。培養は24〜48時間インキュベートし、その後頂メディアが削除されます。 ex vivoでの培養物をトランスウェルフィルター上に完全な、完全な芝生を形成するために5-8日のために拡張されます。 4週間までex vivoでの培養は、この状態でviably維持することができます。漫画5は hemato付きインサートとステンドグラスから除去フィルタの例で十分に成長した生体外での文化の表現を示しています。xylinとエオシン（H＆E）は、ex vivoでの上皮の極性とアーキテクチャを実証する。 図2。 FT ex vivoでの文化の明視野顕微鏡。トランスウェルインサートが（）表示されているヒト胎盤コラーゲン0.4μm孔でコーティングされています。 FT上皮細胞は、それらが上皮層（c）を形成するコラーゲンコートしたインサート（b）に、上で培養されています。いくつかの破片は通常、繊毛細胞に最も頻繁に、（矢印で示す）上皮培養細胞への付着が観察される。 図3。 FT ex vivoで培養免疫蛍光（IF）。 生体外での文化のイメージが（a）の分泌（Pax8）と（d）は線毛細胞（Sall2）マーカーに対する抗体を固定し、染色した場合の例。 DAPIは細胞核の位置（青）（BとE）とマージされた抗体とDAPI染色も（CとF）が表示されるためのコントロールとして使用されます。細胞の数は、細胞が培養している時間の長さ（; Sall2染色、3日間Pax8染色、7日間）に依存します。