Трансплантация клеток непосредственно в почках взрослых данио рерио

1. Кондиционирование нетрансгенных получателя рыбы. Выберите крупнейших мужчины рыбы в системе для трансплантации. Место рыб в 0,02% Tricaine (рН 7) в течение 3 минут или пока он не остановится плавание, но не так долго, что сердце перестает биться. Положите рыбу на анестезию влажным бумажным полотенцем на скамейке наверху. Используйте иглу инсулиновый шприц для введения 40 мкг гентамицин в 20 мкл воды в внутрибрюшинного полости рыбы. Для почечной исследований регенерации, этот шаг важен для стимулирования благоприятной среды для улучшения приживления. Положите рыбу обратно в водную систему для восстановления. Рыба может быть послушным и очень чувствительны к внешним стимулом, таких как вибрация. После 3 часов в режиме восстановления, лечения рыб с 25 серая гамма-облучения. Положите рыбу обратно в систему в течение 3 дней без пищи до трансплантации. 2. Подготовка клеток-предшественников донора генетически помечены флуоресцентным маркером (EGFP или mCherry). Непосредственно перед хирургической процедуры, подготовить донорских клеток для пересадки и держать их на льду. Для почечной исследований, мы используем весь почек клеток костного мозга от Tg (cdh17: EGFP) трансгенной линии, которые содержат функции почек и кроветворных клеток-предшественников. Эти клетки-предшественники, генетически маркировать и только выразить EGFP, если они прижился и дифференцироваться в почечных эпителиальных клеток. Другие типы меченых клеток-предшественников можно также использовать, например, Tg (SCL: EGFP) для гемопоэтических стволовых клеток или Tg (fli1a: EGFP) для ангиобласт прародителей трансплантации. Усыпить 3 взрослых трансгенных рыб, поместив их в 0,2% Tricaine течение 5 минут. Используйте стерилизованные лезвие, чтобы удалить голову и хвост, и рассекает ножницы, чтобы сделать срединный разрез вдоль брюшной стороны. Под стереоскоп, удалить все внутренние органы в полости тела, включая плавательный пузырь с помощью пинцета. Будьте осторожны, чтобы не удалить почку, которая является плоской и пигментных органа прилагаются к спинной стенке полости. Далее, из рассекают почку от дорсальной стенки и поместите его в 1,5 мл центрифужную пробирку, содержащую 300 мкл холодного солевого фосфатного буфера с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки (1X PBS / 2% FCS). Используйте пестиком стричь почки, пока не станет гомогенизации. Место 40 мкм сито ячейка внутри трубки 50 мл Сокол и передачи ячейки решение на верхней части ячейки фильтра, что позволяет свободно клеткам проникать в трубку Falcon. Используйте пестиком, чтобы мягко мазка большие куски ткани, которые остались на фильтр для дальнейшего распада клеток. Оставьте клетка решение в трубке Сокол и мыть сито с 1,2 мл 1X PBS / 2% FCS для сбора остаточных клеток из фильтра. Передача ячейке решение в новой трубки 1,5 мл и центрифуги при 4 ° С при 300 RCF течение 5 минут. Промыть осадок клеток с 1,5 мл 1X PBS / 2% FCS и передать его через новый фильтр для фильтрации сгустки липкого клеток и центрифуга снова. Ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл в 1X PBS / 2% FCS и трансфер в ПЦР-пробирку. Центрифуга ПЦР-пробирку (4 ° C, 300 RCF, 1 мин) и удалить большую часть супернатант. Ресуспендируют клеток в остаточной супернатант, чтобы получить 2-5 мкл конечный объем и сохранить его на лед. Заключительные сотовой выход должен быть около 2 млн. клеток на почки. Подсчитайте количество клеток с гемоцитометра и регулировать концентрацию до 5 х 10 5 клеток в мкл. 3. Нагрузка ячейки раствора в шприце Hamilton. Промойте шприц Гамильтон стерильной водой в 3 раза. Промойте шприц с 75% этанола в 3 раза. Промойте шприц снова 1X PBS / 2% FCS 3 раза. Затем загрузите шприц с 1 мкл клеточной решение содержится примерно 5 х 10 5 клеток непосредственно перед инъекцией. 4. Трансплантация клеток-предшественников, прямо в почки. Обезболить условный рыбы получателя в 0,02% Tricaine в течение примерно 3 минут, или пока рыба перестала двигаться, но не слишком долго, что сердце перестает биться. Под стереомикроскопа, положите рыбу на бумажное полотенце с головы влево, брюшной стороной вверх, для того, чтобы высушить пересаженных стороны. Затем раскатать рыбу подвергать сухой стороне. Использование стерилизовать пинцет, удалите масштабов в регионе сразу же позади жабр. Сделать 1 см боковой разрез в этой области на средней линии с помощью скальпеля при стабилизации ткани с помощью пинцета. Использование пинцета, подвергать ткани, продолжая при этом, чтобы сделать разрез достаточно глубокоподвергать голову почек. Если есть много кровотечение, которое препятствует визуализации почек, euthenize рыбы и начать все заново с другого получателя рыбы. Хотя любопытных ткани открытым, чтобы выставить голову почек, вводят 1 мкл клетка решение непосредственно в головной почки. Затем, в то же время, как иглу шприца в настоящее время восстановлена, релиз пинцетом так, чтобы ткань возвращается на круги своя, чтобы предотвратить утечку вводили клетки. Держите шов игла с водителем иглы и проколет ее через мышцу с каждой стороны разреза. Tie 2 узлов и отрезать избыточного шва. Только один шов необходимо для 1 см разрез. Место рыб в рыбе воды, содержащей 10 частей на миллион Tricaine в течение 5 часов поставлять рыбу с успокаивающим обезболивающее действие. Место рыбу обратно в систему для восстановления нормальной кормлений. После 7-18 дней на восстановление, мы проанализируем рыбы и анализировать приживление почечных клеток-предшественников живыми EGFP флуоресценции. 5. Представитель Результаты: Общей стратегии трансплантации показано на рисунке 1. Для наших почечной исследований, почки рассекается и проанализированы EGFP флуоресценции. Приживление и дифференцировку клеток-предшественников почечной обнаруживается уже в семь дней после пересадки. Об этом свидетельствует наличие нескольких кластеров EGFP + почечных эпителиальных клеток (рис. 2). По состоянию на 18 дней после пересадки, мы обнаруживаем в среднем на 24 EGFP + нефронов, указывая, что донорские клетки сформировали новые ткани почек (рис. 3). Чтобы продемонстрировать долгосрочные приживления, мы расчлененный получателя рыбы 59 дней после трансплантации (рис. 4). Эта рыба имела много нефронов в месте инъекции (красная стрелка) в дополнение к нескольким нефронов в отдаленных районах (белые стрелки), предполагая, что почечные клетки-предшественники являются мигрирующими. Эта техника работает быстрее и более эффективно по сравнению с когда клетки вводятся в оборот через сердце, которое занимает около трех месяцев, чтобы обнаружить приживления. Рисунок 1. Общая схема трансплантации. Нетрансгенных получателя рыбы облученных для подавления иммунного отторжения пересаженных клеток. Три дня спустя, разрез делается на фланге рыбы и клеток доноров предшественники вводятся в голову подвергаются почки. Разрез закрыт с одним швом и рыбу помещают обратно в систему для восстановления. Почки получателя рыбы расчленены на более поздних моментов времени и проанализированы для приживления и прогениторных деятельности. Рисунок 2. Приживления клеток-предшественников, после семи дней. Приживление почечных клеток-предшественников обнаружен на вводили стороне головы, почек в семь дней после пересадки, как это определено наличие кластеров EGFP + почечных эпителиальных клеток (вставка – увеличенное изображение). Рисунок 3. Приживления клеток-предшественников, через 18 дней после 18 дней после пересадки, мы обнаруживаем в среднем на 24 EGFP + доноров полученных нефронов (вставка – увеличенное изображение отдельных EGFP + нефронов).. Рисунок 4. Приживление и миграции клеток-предшественников, через 59 дней. Мы продолжали обнаруживать приживления клеток-предшественников, долгое время после трансплантации, даже после 59 дней (красная голова стрелка). На этом позднем этапе, донорских полученных нефронов обнаружены на участках от места инъекции (белые наконечники стрел), в соответствии с прародитель миграции клеток.