En allmän protokoll för att studera invasion av värdceller genom en bakteriell patogen, med fokus på<em> Staphylococcus aureus</em> Och humana endotelceller.
Här kommer vi att beskriva hur vi studerar invasionen av humana endotelceller genom bakteriell patogen Staphylococcus aureus. Det allmänna protokollet kan användas för studier av cellens invasion av nästan alla odlingsbara bakterie. Stegen där specifika aspekter av invasion kan studeras, till exempel vilken roll aktin ombildning eller caveolae, kommer att markeras. Host celler odlas i behållare och när de är färdiga för användning är seedade i 24-brunnars plattor innehåller Thermanox täckglas. Använda täckglas tillåter avlägsnande av celler från brunnarna för att minska störningar från serumproteiner deponeras på sidorna av brunnar (som S. aureus skulle fästa). Bakterier odlas till önskad densitet och tvättas för att ta bort alla utsöndrade proteiner (t.ex. toxiner). Täckglas med sammanflytande skikt av endotelceller överförs till nya 24-brunnars plattor med färska odlingsmedium innan tillsats av bakterier. Bakterier och celler inkuberas därefter ihop för önskad tid i 5% CO 2 vid 37 ° C. För S. aureus detta är vanligtvis mellan 15-90 minuter. Thermanox täckglasen tas bort från varje brunn och doppa-tvättas i PBS för att ta bort lös bakterier. Om de totala tillhörande bakterier (anhängare och internaliserad) skall kvantifieras, är täckglas placeras sedan i en fräsch och som innehåller 0,5% Triton X-100 i PBS. Skonsam pipettering leder till fullständig cellslys och bakterier räknas upp med seriell utspädning och plätering på agar. Om antalet bakterier som har invaderat cellerna behövs, är täckglas tillsätts brunnar med 500 l medelstora vävnadsodling kompletteras med gentamicin och inkubationen fortsatte i 1 h, vilket kommer att döda alla externa bakterier. Täckglas då kan tvättas, lyserade celler och bakterier räknas upp bordläggningen på agar som beskrivs ovan. Om försöket kräver direkt visualisering kan täckglas fastställas och färgas för ljus, fluorescens eller konfokalmikroskopiska eller iordningställda för elektronmikroskop.
Analysen vi beskriver är baserad på gentamicin skydd-analys som har använts i stor utsträckning för att studera invasion av värdceller av bakterier. Observationer av oförmåga gentamicin och andra antibiotika för att döda intracellulära bakterier som används i tidiga studier på invasionen av värdceller av bakterier 4-8. Användningen av 24, 48 eller ens 96-brunnar tillåter generationen av stora mängder kvantitativa, reproducerbara data i en kort tid och till relativt låg kostnad. Analysen är också intressant eftersom den inte kräver någon specialutrustning, den kan skräddarsys för att arbeta med olika bakterier och celler, och kan användas för att studera betydelsen av både bakterier och värdcell processer i invasionen 9. Ja, eftersom de tidigaste experimenten har gentamicin skydd analysen i stor utsträckning används för att mäta invasion värdcell av en rad olika bakterier eller till och med kombinationer av bakterier 10,11. Även de grundläggande principerna är desamma, många subtila skillnader i metod har rapporterats. I denna artikel har vi beskrivit vår version och visade var ändringar kan vara nödvändiga för andra bakterier eller celler värd. Vid utformning av ett experiment för att mäta invasionen värdcellen som använder denna metod finns det ett antal viktiga punkter att tänka på:
Bakteriell känslighet för gentamicin. Detta kan tyckas självklart, men det är viktigt att se till att bakterien som studeras är mottagliga för gentamicin på koncentration, temperatur och över tidslängden som ska användas. Vid okänslighet, kan det vara möjligt att använda andra antibiotika 5. En alternativ ansats kan vara att använda lytiska enzymer (lysostaphin, mutanolysin, lysozym) 12.
Inkubation och inokulat. När man utför denna analys för första gången är det viktigt att fastställa den optimala inkubationstiderna och bakteriella inokulat som ska användas. Därför bör inledande experiment undersöka både vidhäftning och invasion över tid (5 min till upp till 6 h). Det är också viktigt att bedöma hur invasion påverkas av den mångfald av infektion (MOI, antalet bakterier per cell). I allmänhet är det bäst att använda det minsta antalet bakterier möjligt eftersom detta kommer att minska skador på odlade celler. Viktiga skillnader mellan stammar kan missa om längre inkubationstid eller stora inokulat används 9,13.
Cellskador. Det är viktigt att tvätta bakterier före användning. Dock är cellskador inte begränsad till toxinproduktion. Bakteriell invasion kan induktion av apoptos och störningar av normala cellulära funktioner orsaka alla cellskador. Detta kan leda till penetration av gentamicin in i cellen och dödade internaliserade bakterier och ge intryck av att invasionen inte har inträffat 14.
Ruvning förhållanden. Temperatur och sammansättning odlingsmedium kan ha en betydande inverkan på invasionen. Till exempel är invasionen av HeLa celler av Streptococcus pyogenes beroende av förekomsten av lösliga fibronektin, vilket vanligtvis är närvarande i serum 15. En annan faktor är bakterietillväxt i odlingsmediet under försöket.
Kultur och kvantifiering av intracellulära bakterier. Även om TX-100 inte får döda intracellulära bakterier, kan det hämma deras tillväxt. Som sådan är det viktigt att kontrollera bakteriell replikering på fasta medier i närvaro av rengöringsmedel. Där påverkas, kan det vara möjligt att använda lägre koncentrationer av tvättmedel eller att använda ett alternativt exempel saponin. En fördel med gentamicin skydd analys över kristallviolett färgning och mikroskopi analysen är att det är mindre personalkrävande och det gör att upptäcka och differentiering av delpopulationer av internaliserade bakterier. Till exempel, S. aureus kan producera antingen en vanlig koloni typ (NCT) eller den lilla kolonin variant (SCV) 16, som inte skulle kunna skiljas genom mikroskopi av enskilda bakterieceller. En fördel med kristallviolett färgning och mikroskopi analys över gentamicin skydd analysen är cellen klumpar kan redovisas och att intracellulära bakterier som kommer in en "livskraftig men icke odlingsbara" staten kommer att upptäckas 17.
Undersöka vilken roll processer värdcellens i bakterie invasion. Många studier har anställt hämmare av värdcellens funktion som cytochalasin D, som stör aktin ombildning. Sådana studier kan även innehålla antikroppar som riktar cellytan receptorer och siRNA ÖVERVÄLDIGANDE av specifika gener 18. Det är mycket viktigt att säkerställa att dessa behandlingar inte påverkar lönsamheten eller fastsättning av odlade celler eller har toxiska effekter på bakterier.
Framtida inriktningar:
INNEHÅLL "> Eftersom denna analys vanligen utförs i flera bra plattor cellodling, är det teoretiskt möjligt att anpassa den till en high-throughput screening drift, vilket kan innebära en undersökning av biblioteken i potentiella cell-funktion hämmare, medel mot infektioner eller antibiotika utformade för att rikta intracellulära bakterier. Alternativt kan ett sådant tillvägagångssätt kan användas för att screena muterade bibliotek för att identifiera gener involverade i adhesion, invasion och intracellulär överlevnad. I vissa fall kan det vara önskvärt att skjuvkrafter (flöde) i modellen systemet, till exempel när modellering endotelet, för att närmare efterlikna in vivo-miljö. Aktuella framsteg inom design och tillverkning av flödet celler och mikroflödessystem cellsystem kultur ge möjlighet att anställa gentamicin skydd analysen i värd-patogen modeller som innehåller skjuvkrafter.Sammanfattningsvis är det protokoll som beskrivs här bygger på liknande tillvägagångssätt som används under många år. Det är allmänt tillämpas på många typer av odlade celler och bakteriearter och kan generera stora mängder data snabbt och till relativt låg kostnad.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av Wellcome Trust (WT 0.795.880).
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
DMEM | Invitrogen | 31885-023 | ||
Brain heart infusion | BioChemika | 53286 | ||
Foetal bovine serum | Invitrogen | 10091-148 | ||
HUVECs | Lonza | CC-2519 | ||
Endothelial basal medium | Lonza | CC-3121 | ||
Bovine brain extract (including heparin) | Lonza | CC-4092 | ||
Human endothelial growth factor | Lonza | CC-4017C | ||
Hydrocortisone | Lonza | CC-4035C | ||
GA-1000 | Lonza | CC-4092C | ||
Gentamicin | Invitrogen | 15710 | ||
Lysostaphin | AMBI | LSPN-50 | ||
Thermanox coverslips | Thermo Fisher | TKT-210-330P | ||
Triton X-100 | Sigma | T8787 | ||
Cytopath | TCS Biosciences | HC8595 | ||
Crystal violet | Sigma | C3886 | ||
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | ||
T75 flasks | Thermo Fisher | 430641 | ||
Cytochalasin D | Sigma | C2618 | ||
Methyl-B-cyclodextrin | Sigma | 332615 |