मानव कोशिकाओं के एक बैक्टीरियल पैथोजन द्वारा आक्रमण
Summary
एक जीवाणु रोगज़नक़ द्वारा एक मेजबान कोशिकाओं के आक्रमण की अध्ययन के लिए यह सामान्य प्रोटोकॉल, पर ध्यान केंद्रित<em> Staphylococcus aureus</em> और मानव endothelial कोशिकाओं.
Abstract
यहाँ हम का वर्णन करेंगे कैसे हम बैक्टीरिया रोगज़नक़ Staphylococcus aureus द्वारा मानव endothelial कोशिकाओं के आक्रमण का अध्ययन . सामान्य प्रोटोकॉल वस्तुतः किसी भी कृषि जीवाणु द्वारा सेल आक्रमण के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है. चरणों पर जो आक्रमण के विशिष्ट पहलुओं का अध्ययन किया जा सकता है actin पुनर्व्यवस्था या caveolae की भूमिका के रूप में, पर प्रकाश डाला जाएगा. होस्ट कोशिकाओं बोतल में बड़े हो रहे हैं और जब इस्तेमाल के लिए तैयार 24-अच्छी तरह से Thermanox coverslips युक्त प्लेटों में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं. Coverslips का उपयोग कुओं से कोशिकाओं के बाद हटाने कुओं (जो एस aureus देते हैं) के पक्षों पर जमा सीरम प्रोटीन से हस्तक्षेप को कम करने के लिए अनुमति देता है . जीवाणु आवश्यक घनत्व के लिए बड़े हो रहे हैं और किसी भी secreted प्रोटीन (जैसे जहर) को हटाने के लिए धोया. मिला हुआ परतों के साथ endothelial कोशिकाओं के Coverslips नए 24 अच्छी तरह से बैक्टीरिया के अलावा ताजा संस्कृति के माध्यम से पहले से युक्त प्लेटों के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. समय के लिए आवश्यक राशि के लिए जीवाणु और कोशिकाओं तो एक साथ 37 पर 5% सीओ 2 में incubated डिग्री सेल्सियस एस के लिए aureus यह आमतौर पर 15-90 मिनट के बीच है . Thermanox coverslips प्रत्येक अच्छी तरह से हटा रहे हैं और पीबीएस में डुबकी धोया स्वाधीन बैक्टीरिया को दूर है. यदि कुल जुड़े बैक्टीरिया (पक्षपाती और भली भाँति) के लिए मात्रा निर्धारित हो रहे हैं, coverslips तो एक ताजा अच्छी तरह से में रखा जाता है युक्त 0.5% ट्राइटन पीबीएस में X-100. कोमल pipetting सेल lysis को पूरा करने और बैक्टीरिया धारावाहिक कमजोर पड़ने और चढ़ाना द्वारा अगर पर enumerated हैं होता है. अगर जीवाणुओं की संख्या है कि कोशिकाओं पर आक्रमण किया है की जरूरत है, coverslips कुओं 500 μl ऊतक संस्कृति gentamicin और ऊष्मायन साथ पूरक मध्यम युक्त 1 ज के लिए जारी रखा, जो सभी बाहरी जीवाणुओं को मारने के लिए जोड़ रहे हैं. Coverslips फिर धोया जा सकता है, कोशिकाओं के lysed और बैक्टीरिया अगर पर चढ़ाना द्वारा प्रगणित के रूप में ऊपर वर्णित है. यदि प्रयोग प्रत्यक्ष दृश्य की आवश्यकता है, coverslips और तय किया जा सकता है दाग प्रकाश, प्रतिदीप्ति या confocal माइक्रोस्कोपी के लिए या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार है.
Protocol
Discussion
परख का वर्णन हम gentamicin संरक्षण परख, जो व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है जीवाणुओं द्वारा मेजबान कोशिकाओं के आक्रमण का अध्ययन पर आधारित है. Gentamicin और अन्य intracellular जीवाणुओं को मारने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं की अक्षमता की टिप्पणियों प्रारंभिक अध्ययन में बैक्टीरिया 4-8 से मेजबान कोशिकाओं के आक्रमण पर उपयोग किया गया. 24, 48 या भी 96 अच्छी तरह प्लेटें का उपयोग मात्रात्मक और अपेक्षाकृत कम लागत पर समय की एक छोटी अवधि में, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा की बड़ी मात्रा में के उत्पादन की अनुमति देता है. परख भी आकर्षक है क्योंकि यह कोई विशेषज्ञ के उपकरणों की आवश्यकता है यह विभिन्न जीवाणुओं और कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए सिलवाया किया जा सकता है है, और 9 आक्रमण में दोनों बैक्टीरिया और मेजबान सेल प्रक्रियाओं की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दरअसल, जल्द से जल्द प्रयोगों के बाद, gentamicin संरक्षण परख व्यापक रूप से किया गया है अलग बैक्टीरिया या 10,11 बैक्टीरिया का भी संयोजन की एक श्रृंखला के द्वारा मेजबान सेल आक्रमण को मापने के लिए कार्यरत है. मूल सिद्धांतों के रूप में एक ही विधि में कई सूक्ष्म रूपांतरों रहे हैं की सूचना दी गई है. इस अनुच्छेद में हम अपने संस्करण का वर्णन किया है और संकेत दिया जहां संशोधनों अन्य बैक्टीरिया या मेजबान कोशिकाओं के लिए आवश्यक हो सकता है. जब एक मेजबान सेल महत्वपूर्ण बिंदुओं के एक नंबर पर विचार कर रहे हैं इस दृष्टिकोण का उपयोग आक्रमण को मापने के लिए प्रयोग डिजाइन
Gentamicin के लिए बैक्टीरियल संवेदनशीलता. यह स्पष्ट है, लग सकता है लेकिन यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि अध्ययन किया जा रहा जीवाणु एकाग्रता, तापमान, और समय की अवधि से अधिक के लिए इस्तेमाल किया जा gentamicin के लिए अतिसंवेदनशील है . असंवेदनशीलता के मामले में, यह अन्य एंटीबायोटिक दवाओं 5 का उपयोग संभव हो सकता है. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण lytic (lysostaphin, mutanolysin, lysozyme) एंजाइमों 12 का उपयोग किया जा सकता है .
ऊष्मायन और inoculum जब पहली बार के लिए इस परख प्रदर्शन यह इष्टतम ऊष्मायन बार और बैक्टीरिया के लिए इस्तेमाल किया जा inoculum स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसलिए, प्रारंभिक प्रयोगों दोनों आसंजन और समय पर आक्रमण (6 घंटे के लिए 5 मिनट) जांच करनी चाहिए. यह भी महत्वपूर्ण है आकलन कैसे आक्रमण संक्रमण की बहुलता से प्रभावित है (MOI, सेल प्रति जीवाणुओं की संख्या). सामान्य में यह सबसे अच्छा संभव जीवाणुओं की fewest संख्या के उपयोग के रूप में इस संवर्धित कोशिकाओं को नुकसान कम हो जाएगा. उपभेदों के बीच महत्वपूर्ण मतभेद अगर विस्तारित ऊष्मायन अवधि या बड़े inocula 9,13 इस्तेमाल कर रहे हैं याद किया जा सकता है.
सेलुलर क्षति यह बैक्टीरिया से पहले धो उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, सेलुलर क्षति विष उत्पादन के लिए सीमित नहीं है. जीवाणु आक्रमण, apoptosis और सामान्य सेलुलर कार्यों के विघटन के अधिष्ठापन सभी सेलुलर क्षति पैदा कर सकता है. यह gentamicin सेल में प्रवेश के लिए सीसा, भली भाँति जीवाणुओं को मारने और धारणा है कि आक्रमण 14 नहीं हुआ है दे सकते हैं.
ऊष्मायन शर्तों तापमान की संरचना और संस्कृति के माध्यम आक्रमण पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है. उदाहरण के लिए, HELA कोशिकाओं के Streptococcus pyogenes द्वारा आक्रमण घुलनशील fibronectin, जो आम तौर पर 15 सीरम में मौजूद है की उपस्थिति पर निर्भर है . एक और विचार के प्रयोग के दौरान संस्कृति माध्यम में बैक्टीरिया विकास है.
संस्कृति और intracellular जीवाणुओं की मात्रा का ठहराव हालांकि TX-100 intracellular जीवाणु नहीं मार सकता है. यह उनके विकास को बाधित कर सकते हैं. जैसे, यह ठोस मीडिया पर डिटर्जेंट की उपस्थिति में बैक्टीरिया प्रतिकृति की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है. कहाँ प्रभावित, यह संभव हो सकता है डिटर्जेंट के कम सांद्रता का उपयोग या सैपोनिन जैसे एक विकल्प का उपयोग हो सकता है. क्रिस्टल बैंगनी धुंधला और माइक्रोस्कोपी परख पर gentamicin संरक्षण परख की एक और लाभ यह है कि कम श्रम गहन है, और यह पता लगाने और भली भाँति जीवाणुओं की उप आबादी के भेदभाव की अनुमति देता है. उदाहरण के लिए एस. aureus या तो एक सामान्य कॉलोनी (राष्ट्रीय राजधानी क्षेत्र) के प्रकार या छोटे कॉलोनी (SCV) संस्करण 16, जो व्यक्तिगत बैक्टीरियल कोशिकाओं के माइक्रोस्कोपी से अलग पहचाना नहीं होगा उत्पादन कर सकते हैं. क्रिस्टल बैंगनी और gentamicin संरक्षण परख अधिक माइक्रोस्कोपी परख धुंधला का एक लाभ यह है सेल clumping के लिए और है कि intracellular जीवाणु है कि 'एक व्यवहार्य लेकिन गैर कृषि' राज्य पता लगाया जाएगा 17 दर्ज हिसाब किया जा सकता है.
जीवाणु आक्रमण में मेजबान कोशिका प्रक्रियाओं की भूमिका की जांच करना. कई अध्ययनों से cytochalasin डी, जो actin पुनर्व्यवस्था के साथ हस्तक्षेप के रूप में मेजबान सेल समारोह के inhibitors कार्यरत है. इस तरह के अध्ययन को भी एंटीबॉडी शामिल कर सकते हैं कि लक्ष्य कक्ष सतह रिसेप्टर्स और विशिष्ट 18 जीनों की siRNA पछाड़ना . यह vitally महत्वपूर्ण है करने के लिए सुनिश्चित करें कि इन उपचार या संवर्धित कोशिकाओं की व्यवहार्यता लगाव को प्रभावित नहीं है या बैक्टीरिया पर विषाक्त प्रभाव है.
भविष्य दिशाओं:
ontent "> क्योंकि इस परख आम तौर पर बहु - अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों में किया जाता है, यह सैद्धांतिक रूप से संभव है यह एक स्क्रीनिंग उच्च throughput ऑपरेशन है, जो संभावित सेल समारोह inhibitors के पुस्तकालयों की परीक्षा, विरोधी infectives या शामिल हो सकता है के लिए अनुकूल intracellular जीवाणु लक्ष्य बनाया एंटीबायोटिक दवाओं वैकल्पिक रूप से, इस तरह के एक दृष्टिकोण उत्परिवर्ती पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए आसंजन, आक्रमण या intracellular अस्तित्व में शामिल जीनों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कुछ मामलों में यह वांछनीय हो सकता है कतरनी बलों (प्रवाह) मॉडल प्रणाली में शामिल हो सकता है. उदाहरण के लिए जब endothelium मॉडलिंग, और अधिक बारीकी से vivo वातावरण में नकल प्रवाह कोशिकाओं और microfluidic सेल संस्कृति प्रणालियों के डिजाइन और निर्माण में वर्तमान प्रगति. मेजबान रोगज़नक़ मॉडल है कि कतरनी बलों को शामिल में gentamicin संरक्षण परख रोजगार की संभावना प्रदान.सारांश में, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल इसी तरह कई वर्षों से अधिक इस्तेमाल किया दृष्टिकोण पर आधारित है. यह व्यापक रूप से संवर्धित कोशिकाओं और बैक्टीरियल प्रजातियों के कई प्रकार के लिए लागू है और डेटा की बड़ी मात्रा में उत्पन्न कर सकते हैं जल्दी और अपेक्षाकृत कम लागत पर.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम वेलकम ट्रस्ट (0795880 WT) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 31885-023 | ||
| Brain heart infusion | BioChemika | 53286 | ||
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10091-148 | ||
| HUVECs | Lonza | CC-2519 | ||
| Endothelial basal medium | Lonza | CC-3121 | ||
| Bovine brain extract (including heparin) | Lonza | CC-4092 | ||
| Human endothelial growth factor | Lonza | CC-4017C | ||
| Hydrocortisone | Lonza | CC-4035C | ||
| GA-1000 | Lonza | CC-4092C | ||
| Gentamicin | Invitrogen | 15710 | ||
| Lysostaphin | AMBI | LSPN-50 | ||
| Thermanox coverslips | Thermo Fisher | TKT-210-330P | ||
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | ||
| Cytopath | TCS Biosciences | HC8595 | ||
| Crystal violet | Sigma | C3886 | ||
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | ||
| T75 flasks | Thermo Fisher | 430641 | ||
| Cytochalasin D | Sigma | C2618 | ||
| Methyl-B-cyclodextrin | Sigma | 332615 |
Referências
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