La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación
Summary
Se demuestra una<em> In vivo</em> Electroporación protocolo para la transfección de grupos individuales o pequeños grupos de células ganglionares de la retina (CGR) y otros tipos de células de la retina en ratones postnatales en un amplio rango de edades. La capacidad de etiquetar y manipular genéticamente CGR postnatal<em> In vivo</em> Es una poderosa herramienta para los estudios de desarrollo.
Abstract
La selección y el refinamiento de las proyecciones de RGC para el cerebro medio es un sistema modelo popular y de gran alcance para el estudio de cómo los patrones precisos de la forma de conectividad neuronal durante el desarrollo. En los ratones, las proyecciones retinofugal están dispuestos de una manera topográfica y la forma del ojo específicos de las capas del núcleo geniculado lateral (dLGN) del tálamo y el colículo superior (SC). El desarrollo de estos patrones precisos de proyecciones retinofugal típicamente ha sido estudiado por el etiquetado las poblaciones de la CGR con tintes fluorescentes y marcadores, como la peroxidasa de rábano picante 1-4. Sin embargo, estos métodos son demasiado gruesas para dar una idea de los cambios de desarrollo en cada morfología axonal RGC cenador que son la base de la formación del mapa retinotópica. Asimismo, no permitir la manipulación genética de la CGR.
Recientemente, la electroporación se ha convertido en un método eficaz para proporcionar un control preciso espacial y temporal para la entrega de las moléculas cargadas en la retina 05.11. Los protocolos actuales de electroporación retina no permiten la manipulación genética y la localización de las proyecciones de retinofugal de un solo grupo o pequeño de la CGR en ratones postnatales. Se ha argumentado que después del parto pt la electroporación in vivo no es un método viable para la transfección CGR desde el etiquetado de eficiencia es muy baja y por lo tanto requiere dirigidos a edades embrionarias cuando los progenitores RGC están experimentando la diferenciación y la proliferación de 6.
En este video se describe un protocolo de electroporación in vivo para la entrega selectiva de genes, shRNA, y dextranos fluorescentes para CGR murino después del nacimiento. Esta técnica proporciona una solución eficaz, rápida y relativamente fácil de plataforma para la detección eficaz de los genes candidatos involucrados en varios aspectos del desarrollo neural como la retracción del axón, la ramificación, la laminación, la regeneración y la formación de sinapsis en las distintas etapas del desarrollo del circuito. En resumen, como se describe aquí una valiosa herramienta que ofrecerá nuevas perspectivas sobre los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo del mapa sensorial.
Protocol
Discussion
En este video se demuestra un protocolo de electroporación in vivo que se traduce en el etiquetado de los grupos individuales o pequeños de las neuronas de la retina en ratones postnatales, con construcciones de ADN que codifican las proteínas fluorescentes. Pequeños grupos de marcado con fluorescencia proyecciones CGR a la dLGN SC y reproduce patrones similares de proyección ya que estudios previos con el etiquetado de CGR con colorantes lipofílicos, lo que indica que la electroporación no inte…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El plásmido pCAG-gapEGFP fue un regalo del doctor S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato plásmido fue un regalo del doctor Feller M. (Berkeley, CA). Agradecemos al Dr. Edward Ruthazer por sugerir el uso de una estrategia de dos plásmidos para el etiquetado de células individuales y Schohl Anne (Montreal, QC) para validar los dos plásmidos Cre / loxP estrategia en los estudios piloto y los miembros de Crair de laboratorio para soporte técnico. Con el apoyo de R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) y NIH P30 EY000785 (MC).
Materials
| Materials | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Electrical Stimulator | Grass Instruments | Model S4 |
| Oscilloscope | Agilent | Model 54621A |
| Audio monitor | Grass Instruments | Model AM8B |
| Puller | Sutter Instruments | Model P-97 |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments | 14003 |
| Micro Scissors b | Ted Pella | 1347 |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 |
| DiI | Invitrogen | D-383 |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 |
Referências
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