Трансфекция Мышь ганглиозных клеток сетчатки при В естественных условиях Электропорация
Summary
Мы демонстрируем<em> В естественных условиях</em> Электропорации протокол для трансфекции одного или небольших групп ганглиозных клеток сетчатки (РГК) и другие типы клеток сетчатки в постнатальном мышей в широком диапазоне возрастов. Возможность маркировать и генетически манипулировать послеродовой РГК<em> В естественных условиях</em> Является мощным инструментом для развития исследований.
Abstract
Адресности и уточнение РГК проекции среднего мозга является популярным и мощным модельной системы для изучения того, как точной модели нейронной форма связи в процессе разработки. У мышей, retinofugal прогнозы расположены в топографических порядке и по форме глаз конкретных слоев наружного коленчатого тела (dLGN) таламуса и верхний бугорок (SC). Развитие этих точных моделей retinofugal прогнозы как правило, были изучены маркировки популяций РГК с флуоресцентными красителями и индикаторов, таких, как пероксидаза хрена 1-4. Однако, эти методы слишком грубы, чтобы дать представление о развитии изменений в отдельные РГК аксонального морфологии беседки, которые являются основой retinotopic формирование карты. Они также не позволяют генетические манипуляции РГК.
В последнее время электропорации стала эффективным методом для обеспечения точной пространственной и временной контроль на поставку заряженных молекул в сетчатку 5-11. Текущий сетчатки протоколов электропорации не позволяют генетических манипуляций и отслеживание retinofugal проекции одного или небольшой кластер РГК в постнатальном мышей. Утверждалось, что в послеродовом электропорации естественных условиях не является жизнеспособным методом трансфекции РГК с маркировки эффективность крайне мала и, следовательно, требует ориентации на эмбриональном возрасте, когда RGC прародителей проходят дифференциации и пролиферации 6.
В этом видео мы описываем в естественных условиях электропорации протокол для адресной доставки генов, shRNA и флуоресцентные декстраны с мышиным РГК постнатально. Эта техника представляет собой экономически эффективный, быстрый и относительно легко платформу для эффективного скрининга генов-кандидатов, участвующих в нескольких аспектах развития нервной системы, включая аксон опровержение, ветвящийся, ламинирование, регенерацию и формирование синапса на различных этапах схемы развития. В заключение мы описываем здесь ценным инструментом, который обеспечит более полное представление о молекулярных механизмах основной сенсорное развитие карте.
Protocol
Discussion
В этом видео мы демонстрируем в протокол электропорации естественных условиях, что приводит к маркировке одного или небольших групп нейронов сетчатки в постнатальном мышей с ДНК-конструкции кодирования флуоресцентных белков. Малые кластеры флуоресцентно меченных РГК прое?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCAG-gapEGFP плазмиду подарок от д-р С. Макконнелл (Стэнфорд, Калифорния). pCAG-tdTomato плазмиду подарок от д-ра М. Феллер (Беркли, Калифорния). Мы благодарим д-р Эдвард Ruthazer за предложение использование двух плазмид стратегии для одной маркировки клеток и Энн Schohl (Montreal, QC) для проверки двух плазмид Cre / loxP стратегии в экспериментальных исследованиях и членов Crair лабораторию для технической поддержки. Поддержка R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) и NIH P30 EY000785 (МК).
Materials
| Materials | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Electrical Stimulator | Grass Instruments | Model S4 |
| Oscilloscope | Agilent | Model 54621A |
| Audio monitor | Grass Instruments | Model AM8B |
| Puller | Sutter Instruments | Model P-97 |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments | 14003 |
| Micro Scissors b | Ted Pella | 1347 |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 |
| DiI | Invitrogen | D-383 |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 |
Referências
- Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields. Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).
- McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O’Leary, D. D. Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development. Neuron. 40, 1147-1160 (2003).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse. J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).
- Jaubert-Miazza, L. Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse. Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Analysis of gene function in the retina. Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
- Ishikawa, H. Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode. Gene Ther. 12, 289-298 (2005).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T., Yuste, R., Konnerth, A. In vivo time- lapse imaging of neuronal development. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 191-204 .
- Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. Nonviral ocular gene transfer. Gene Ther. 12, 843-851 (2005).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).
- Plas, D. T. morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse. J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).
