Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação
Summary
Nós demonstramos uma<em> In vivo</em> Protocolo de eletroporação para transfecting aglomerados único ou pequeno de células ganglionares da retina (RGCs) e outros tipos de células da retina em ratos pós-natal em uma ampla faixa de idades. A capacidade de rótulo e manipular geneticamente RGCs pós-natal<em> In vivo</em> É uma ferramenta poderosa para estudos de desenvolvimento.
Abstract
A segmentação e refinamento das projeções para o mesencéfalo RGC é um sistema de modelo popular e poderosa para o estudo de como os padrões precisos de forma a conectividade neural durante o desenvolvimento. Em camundongos, as projeções retinofugal estão dispostos de uma forma topográfica e forma dos olhos específicas camadas no núcleo geniculado lateral (dLGN) do tálamo e colículo superior (SC). O desenvolvimento desses padrões precisos de projeções retinofugal tem sido tipicamente estudados pela rotulagem populações de RGCs com corantes fluorescentes e marcadores, tais como peroxidase 1-4. No entanto, estes métodos são muito grosseiro para fornecer informações sobre alterações de desenvolvimento em cada morfologia arbor RGC axonal que são a base da formação do mapa retinotopic. Eles também não permitem a manipulação genética de RGCs.
Recentemente, a eletroporação tornou-se um método eficaz para proporcionar o controle espacial e temporal preciso para entrega de moléculas carregadas na retina 11/05. Atuais protocolos de eletroporação da retina não permitem a manipulação genética eo rastreamento de projeções retinofugal de um único cluster ou pequena de RGCs em ratos pós-natal. Tem sido argumentado que a pós-natal em eletroporação in vivo não é um método viável para transfecting RGCs desde a rotulagem de eficiência é extremamente baixa e, portanto, requer a segmentação em idades embrionárias quando progenitores RGC são submetidos a diferenciação e proliferação 6.
Neste vídeo nós descrevemos um protocolo de eletroporação in vivo para a entrega prevista para genes, shRNA, e dextranos fluorescentes para RGCs murino pós-natal. Esta técnica proporciona um custo efetivo, rápido e relativamente fácil para plataforma de triagem eficiente de genes candidatos envolvidos em vários aspectos do desenvolvimento neural, incluindo retração axônio, ramificação, laminação, regeneração e formação de sinapses em vários estágios de desenvolvimento do circuito. Em resumo, descrevemos aqui uma valiosa ferramenta que irá fornecer mais ideias sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento mapa sensorial.
Protocol
Discussion
Neste vídeo mostramos um protocolo de eletroporação in vivo que resulta em rotulagem de clusters único ou pequeno de neurônios da retina em ratos pós-natal com as construções de DNA que codificam proteínas fluorescentes. Pequenos grupos de fluorescente etiquetado projeções para o RGC dLGN e SC reproduzida padrões projeção semelhante como estudos anteriores usando rotulagem RGC com corantes lipofílicos, indicando que eletroporação não interferiu normais RGC refinamento arbor axônio. Nós utili…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O plasmídeo pCAG-gapEGFP foi um presente do Dr. S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato plasmídeo foi um presente do Dr. M. Feller (Berkeley, CA). Agradecemos ao Dr. Edward Ruthazer para sugerir o uso de uma estratégia de duas plasmídeo para a rotulagem única célula e Schohl Anne (Montreal, QC) para validar os dois plasmídeo estratégia Cre / loxP em estudos-piloto e membros de laboratório Crair para suporte técnico. Apoiada por R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) e NIH P30 EY000785 (MC).
Materials
| Materials | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Electrical Stimulator | Grass Instruments | Model S4 |
| Oscilloscope | Agilent | Model 54621A |
| Audio monitor | Grass Instruments | Model AM8B |
| Puller | Sutter Instruments | Model P-97 |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments | 14003 |
| Micro Scissors b | Ted Pella | 1347 |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 |
| DiI | Invitrogen | D-383 |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 |
Referências
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