Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione
Summary
Ci mostrano un<em> In vivo</em> Protocollo di elettroporazione per trasfezione singoli o piccoli gruppi di cellule gangliari della retina (RGCs) e altri tipi di cellule della retina nei topi postnatale in un ampio intervallo di età. La capacità di etichetta e manipolare geneticamente RGCs postnatale<em> In vivo</em> È un potente strumento per gli studi di sviluppo.
Abstract
Il targeting e la raffinatezza di proiezioni RGC al mesencefalo è un sistema modello popolare e potente per studiare come schemi precisi di forma connettività neurale durante lo sviluppo. Nei topi, proiezioni retinofugal sono disposti in modo topografico e la forma degli occhi-specifica i livelli del nucleo genicolato laterale (dLGN) del talamo e il collicolo superiore (SC). Lo sviluppo di tali schemi precisi di proiezioni retinofugal è generalmente stata studiata mediante l'etichettatura popolazioni di RGCs con tinture fluorescenti e traccianti, come la perossidasi di rafano 1-4. Tuttavia, questi metodi sono troppo grossolana per fornire la visibilità delle modifiche di sviluppo nei singoli RGC morfologia assonale pergolato che sono alla base della formazione di mappa retinotopica. Inoltre non consentono la manipolazione genetica di RGCs.
Recentemente, elettroporazione è diventato un metodo efficace per fornire un controllo preciso spaziale e temporale per la consegna di molecole cariche nella retina 5-11. Attuali protocolli di elettroporazione della retina non consentono la manipolazione genetica e la rintracciabilità di proiezioni retinofugal di un singolo cluster o piccole RGCs nei topi postnatale. Si è sostenuto che dopo la nascita de elettroporazione in vivo non è un metodo praticabile per trasfezione RGCs poiché l'efficienza di etichettatura è estremamente bassa e, quindi, richiede targeting in età embrionale quando progenitori RGC sono in fase di differenziazione e la proliferazione 6.
In questo video possiamo descrivere un protocollo di elettroporazione in vivo per la somministrazione mirata di geni, shRNA e destrani fluorescenti a RGCs murino dopo la nascita. Questa tecnica fornisce una soluzione efficace, veloce e relativamente facile piattaforma efficace per lo screening di geni candidati coinvolti in diversi aspetti dello sviluppo neurale tra cui retrazione assone, ramificazione, laminazione, rigenerazione e formazione di sinapsi nelle varie fasi di sviluppo del circuito. In sintesi descriviamo qui un prezioso strumento che fornirà ulteriori approfondimenti sui meccanismi molecolari alla base dello sviluppo sensoriale mappa.
Protocol
Discussion
In questo video ci mostrano un protocollo di elettroporazione in vivo che si traduce in etichettatura dei singoli cluster o piccolo di neuroni della retina nei topi postnatale con costrutti di DNA codifica proteine fluorescenti. Piccoli gruppi di fluorescente proiezioni RGC al dLGN e SC riprodotti schemi di proiezione simile a quello degli studi precedenti utilizzando l'etichettatura RGC con coloranti lipofilici, indicando che elettroporazione non interferire con le normali raffinatezza RGC assone per…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il pCAG-gapEGFP plasmide era un dono dal Dott. S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato plasmide è stato un dono di Feller Dr. M. (Berkeley, CA). Ringraziamo il Dr. Edward Ruthazer per aver suggerito l'utilizzo di due plasmide strategia per l'etichettatura singola cellula e Anne Schohl (Montreal, QC) per la validazione dei due plasmide Cre / loxP strategia in studi pilota e membri laboratorio Crair per il supporto tecnico. Supportato da R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) e NIH P30 EY000785 (MC).
Materials
| Materials | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Electrical Stimulator | Grass Instruments | Model S4 |
| Oscilloscope | Agilent | Model 54621A |
| Audio monitor | Grass Instruments | Model AM8B |
| Puller | Sutter Instruments | Model P-97 |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments | 14003 |
| Micro Scissors b | Ted Pella | 1347 |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 |
| DiI | Invitrogen | D-383 |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 |
Referências
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