माउस रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के द्वारा अभिकर्मक Vivo में Electroporation
Summary
हम एक का प्रदर्शन<em> Vivo में</em> रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (RGCs) और अन्य उम्र के एक विस्तृत रेंज पर प्रसव के बाद चूहों में रेटिना सेल प्रकार के एकल या छोटे समूहों transfecting के लिए electroporation प्रोटोकॉल. लेबल और आनुवंशिक प्रसवोत्तर RGCs हेरफेर करने की क्षमता<em> Vivo में</em> विकासात्मक अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है.
Abstract
लक्ष्यीकरण और midbrain के लिए RGC अनुमानों के शोधन के विकास के दौरान कैसे तंत्रिका कनेक्टिविटी के फार्म का सटीक पैटर्न के अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय और शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है. चूहों में, retinofugal अनुमानों एक स्थलाकृतिक तरीके और पार्श्व Geniculate न्यूक्लियस में आँख विशिष्ट परतों के फार्म thalamus और सुपीरियर Colliculus (अनुसूचित जाति) के (dLGN) में व्यवस्थित होते हैं. retinofugal अनुमानों के इन सटीक पैटर्न के विकास आम तौर पर RGCs के फ्लोरोसेंट रंजक और tracers के साथ 1-4 peroxidase हॉर्सरैडिश जैसे, आबादी लेबलिंग द्वारा अध्ययन किया गया है. हालांकि, इन तरीकों भी व्यक्तिगत RGC axonal कुंज आकारिकी में विकास परिवर्तन है कि retinotopic नक्शे गठन के आधार हैं में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए मोटे हैं. उन्होंने यह भी RGCs के आनुवंशिक हेरफेर के लिए अनुमति नहीं है.
हाल ही में, electroporation चार्ज अणुओं के 5-11 रेटिना में प्रसव के लिए सटीक स्थानिक और लौकिक नियंत्रण प्रदान करने के लिए एक कारगर तरीका बन गया है . वर्तमान रेटिना electroporation प्रोटोकॉल आनुवंशिक हेरफेर के लिए अनुमति नहीं है और प्रसव के बाद चूहों में RGCs की एक एकल या छोटे समूह के retinofugal अनुमानों की अनुरेखण. यह तर्क दिया है कि vivo electroporation में प्रसवोत्तर transfecting RGCs के बाद से लेबलिंग दक्षता बेहद कम है के लिए एक व्यवहार्य तरीका है और इसलिए नहीं है भ्रूण उम्र जब RGC progenitors 6 प्रसार और भेदभाव के दौर से गुजर रहे हैं पर लक्षित की आवश्यकता है.
इस वीडियो में हम जीन की लक्षित वितरण, shRNA, और murine postnatally RGCs फ्लोरोसेंट dextrans के लिए vivo electroporation प्रोटोकॉल में एक वर्णन . इस तकनीक एक प्रभावी, लागत तेजी से उम्मीदवार अक्षतंतु तर्क सहित तंत्रिका विकास के कई पहलुओं में शामिल जीनों के कुशल स्क्रीनिंग के लिए और अपेक्षाकृत आसान मंच प्रदान करता है, शाखाओं में बंटी, फाड़ना उत्थान, और सर्किट विकास के विभिन्न चरणों में synapse गठन. संक्षेप में हम यहाँ एक महत्वपूर्ण उपकरण है जो आणविक संवेदी नक्शे विकास अंतर्निहित तंत्र में आगे अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा वर्णन.
Protocol
Discussion
इस वीडियो में हम vivo electroporation प्रोटोकॉल में एक दिखाना है कि डीएनए फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग constructs के साथ प्रसव के बाद चूहों में रेटिना न्यूरॉन्स की एकल या छोटे समूहों के लेबलिंग में परिणाम है . Fluorescent…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pCAG – gapEGFP प्लाज्मिड डॉ. एस McConnell (स्टैनफोर्ड, CA) से एक उपहार था. प्लाज्मिड pCAG – tdTomato डॉ. एम. पेड़ काटने वाला (बर्कले, CA) से एक उपहार था. हम दो प्लाज्मिड एकल कक्ष लेबलिंग और दो प्लाज्मिड तकनीकी सहायता के लिए Cre / loxP पायलट अध्ययन और Crair प्रयोगशाला के सदस्यों में रणनीति मान्य करने के लिए ऐनी Schohl (मॉन्ट्रियल, QC) के लिए एक रणनीति के उपयोग का सुझाव के लिए धन्यवाद डॉ. एडवर्ड Ruthazer. R01 (एमसी) MH62639, एनआईएच EY015788 R01 (एमसी) और NIH p30 EY000785 (एमसी) द्वारा समर्थित है.
Materials
| Materials | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Electrical Stimulator | Grass Instruments | Model S4 |
| Oscilloscope | Agilent | Model 54621A |
| Audio monitor | Grass Instruments | Model AM8B |
| Puller | Sutter Instruments | Model P-97 |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments | 14003 |
| Micro Scissors b | Ted Pella | 1347 |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 |
| DiI | Invitrogen | D-383 |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 |
Referências
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