Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation
Summary
אנו מדגימים<em> In vivo</em> Electroporation פרוטוקול transfecting אשכולות יחיד או קטן של תאים הגנגליון ברשתית (RGCs) ושאר סוגי תאים ברשתית אצל עכברים לאחר הלידה על פני טווח רחב של גילאים. היכולת התווית גנטית לתפעל RGCs לאחר הלידה<em> In vivo</em> הוא כלי רב עוצמה למחקרים התפתחותיים.
Abstract
מיקוד ועידון של תחזיות RGC אל המוח התיכון, היא מערכת מודל פופולרי ורב עוצמה ללימוד כיצד דפוסים מדויקים של טופס קישוריות עצבית במהלך ההתפתחות. בעכברים, תחזיות retinofugal מסודרים בצורה טופוגרפית ובצורה ספציפית עין שכבות בגרעין הברכיתי הרוחב (dLGN) של התלמוס ואת Colliculus מעולה (SC). הפיתוח של דפוסים אלה המדויק של תחזיות retinofugal יש בדרך כלל נחקרה על ידי תיוג אוכלוסיות RGCs עם צבעים קליעים נותבים ניאון, כגון peroxidase חזרת 1-4. עם זאת, שיטות אלו גס גם כדי לספק תובנה לגבי שינויים התפתחותיים אצל אדם מורפולוגיה RGC סוכת axonal כי הם הבסיס של היווצרות המפה retinotopic. הם גם אינם מאפשרים מניפולציה גנטית של RGCs.
לאחרונה, electroporation הפכה שיטה יעילה עבור מתן שליטה במרחב ובזמן מדויק עבור משלוח של מולקולות טעונים לתוך הרשתית 5-11. שוטפים ופרוטוקולים electroporation ברשתית אינם מאפשרים מניפולציה גנטית מעקב אחר תחזיות retinofugal מקבץ קטן של יחיד או RGCs בעכברים לאחר הלידה. נטען כי לאחר הלידה ב electroporation vivo אינה שיטה מעשית עבור transfecting RGCs מאז יעילות תיוג הוא נמוך ביותר, ולכן דורש מיקוד בגילאים עובריים, כאשר אבות RGC עוברים בידול ריבוי 6.
בסרט זה אנו מתארים בפרוטוקול electroporation vivo למסירה ממוקד של גנים, shRNA ו dextrans ניאון RGCs Murine אחרי הלידה. טכניקה זו מספקת חסכוני, מהיר פלטפורמה קלה יחסית לסינון יעיל של גנים מועמדים מעורב בכמה היבטים של ההתפתחות העצבית כולל נסיגת האקסון, מסתעפת, למינציה, התחדשות היווצרות הסינפסה בשלבים שונים של פיתוח מעגל. לסיכום נתאר כאן כלי רב ערך אשר יספקו תובנות נוספות המנגנונים המולקולריים שבבסיס פיתוח המפה חושית.
Protocol
Discussion
בסרטון הזה אנחנו מדגימים בפרוטוקול electroporation vivo כי התוצאות תיוג של אשכולות יחיד או קטן של נוירונים ברשתית אצל עכברים לאחר הלידה עם בונה DNA קידוד חלבוני ניאון. אשכולות קטנים של תחזיות RGC שכותרתו fluorescently את dLGN ו SC לשכפל דפוסי השלכה דומה כמו במחקרים קודמים באמצעו…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCAG-gapEGFP הפלסמיד היה מתנה ד"ר ס מקונל (סטנפורד, קליפורניה). pCAG-tdTomato פלסמיד הייתה מתנה מ ד"ר פלר (ברקלי, CA). אנו מודים ד"ר אדוארד Ruthazer עבור מציע את השימוש באסטרטגיה של שתי פלסמיד תיוג תא בודד ואן Schohl (Montreal, QC) עבור אימות שני פלסמיד Cre / loxP אסטרטגיה בלימודי טייס וחברי Crair מעבדה לקבלת תמיכה טכנית. נתמך על ידי R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) ו-NIH P30 EY000785 (MC).
Materials
| Materials | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Electrical Stimulator | Grass Instruments | Model S4 |
| Oscilloscope | Agilent | Model 54621A |
| Audio monitor | Grass Instruments | Model AM8B |
| Puller | Sutter Instruments | Model P-97 |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments | 14003 |
| Micro Scissors b | Ted Pella | 1347 |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 |
| DiI | Invitrogen | D-383 |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 |
Referências
- Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields. Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).
- McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O’Leary, D. D. Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development. Neuron. 40, 1147-1160 (2003).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse. J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).
- Jaubert-Miazza, L. Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse. Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Analysis of gene function in the retina. Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
- Ishikawa, H. Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode. Gene Ther. 12, 289-298 (2005).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T., Yuste, R., Konnerth, A. In vivo time- lapse imaging of neuronal development. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 191-204 .
- Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. Nonviral ocular gene transfer. Gene Ther. 12, 843-851 (2005).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).
- Plas, D. T. morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse. J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).
