Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation
Summary
Wir zeigen eine<em> In vivo</em> Elektroporation Protokoll zur Transfektion von einzelnen oder kleinen Gruppen von retinalen Ganglienzellen (RGC) und anderen Zelltypen der Netzhaut in postnatalen Mäusen über einen weiten Altersbereich. Die Fähigkeit, Label und genetisch manipulieren postnatale RGCs<em> In vivo</em> Ist ein leistungsfähiges Werkzeug für Entwicklungsstudien.
Abstract
Die Ausrichtung und Weiterentwicklung des RGC Projektionen zum Mittelhirn ist ein beliebtes und leistungsfähiges Modell für die Untersuchung, wie präzise Muster der neuronalen Konnektivität Form während der Entwicklung. Bei Mäusen sind retinofugal Projektionen in eine topographische Art und Form ins Auge bestimmten Schichten im Corpus geniculatum laterale (dLGN) des Thalamus und der Colliculus superior (SC) angeordnet. Die Entwicklung dieser präzisen Mustern retinofugal Projektionen hat in der Regel durch die Kennzeichnung Populationen RGCs mit Fluoreszenzfarbstoffen und Tracer, wie Meerrettichperoxidase 1-4 untersucht worden. Allerdings sind diese Methoden zu grob, um Einblick in die entwicklungsbedingten Veränderungen in einzelnen RGC axonalen Laube Morphologie, die die Grundlage retinotopen Karte Formation geben. Sie haben auch nicht für die genetische Manipulation von RGCs ermöglichen.
Vor kurzem hat der Elektroporation werden eine effektive Methode für eine präzise räumliche und zeitliche Steuerung für die Lieferung von geladenen Molekülen in der Netzhaut 5-11. Aktuelle Netzhaut Elektroporation Protokolle nicht zur genetischen Manipulation ermöglichen und die Rückverfolgung von retinofugal Projektionen eines Einzel-oder kleine Gruppe von RGCs in postnatalen Mäusen. Es wurde argumentiert, dass postnatale in vivo Elektroporation ist keine praktikable Methode zur Transfektion von RGCs seit dem Etikett Effizienz ist sehr gering und erfordert daher gezielt an embryonalen Alter, wenn RGC Vorfahren durchlaufen Differenzierung und Proliferation 6.
In diesem Video beschreiben wir eine in vivo Elektroporation Protokoll für die gezielte Verabreichung von Genen, shRNA und fluoreszierende Dextrane auf murine RGCs postnatal. Diese Technik bietet eine kostengünstige, schnelle und relativ einfache Plattform für effizientes Screening von Kandidatengenen in verschiedene Aspekte der Entwicklung des Nervensystems einschließlich Axon Rückziehen beteiligt, Verzweigungen, Laminieren, Regeneration und Synapsenbildung in verschiedenen Stadien der Entwicklung des Schaltplans. Zusammenfassend beschreiben wir hier ein wertvolles Werkzeug, das weitere Einblicke in die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sensorischer map Entwicklung zur Verfügung stellt.
Protocol
Discussion
In diesem Video zeigen wir eine in vivo Elektroporation Protokoll, dass die Ergebnisse bei der Kennzeichnung von einzelnen oder kleinen Gruppen von retinalen Neuronen im postnatalen Mäusen mit DNA-Konstrukte kodieren fluoreszierende Proteine. Kleine Gruppen von fluoreszenzmarkierten RGC Projektionen auf die dLGN und SC reproduziert ähnliche Projektion Muster wie in früheren Studien mit RGC Kennzeichnung mit lipophilen Farbstoffen, was darauf hinweist, dass die Elektroporation nicht mit normalen RGC Axon Laub…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die pCAG-gapEGFP Plasmid war ein Geschenk von Dr. S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato Plasmid war ein Geschenk von Dr. M. Feller (Berkeley, CA). Wir danken Dr. Edward Ruthazer für die Annahme, die Verwendung einer Zwei-Plasmid-Strategie für die einzelne Zelle Kennzeichnung und Anne Schohl (Montreal, QC) für die Validierung der Zwei-Plasmid-Cre / loxP-Strategie in Pilotstudien und Crair lab Mitglieder für den technischen Support. Unterstützt durch R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) und NIH P30 EY000785 (MC).
Materials
| Materials | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Electrical Stimulator | Grass Instruments | Model S4 |
| Oscilloscope | Agilent | Model 54621A |
| Audio monitor | Grass Instruments | Model AM8B |
| Puller | Sutter Instruments | Model P-97 |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments | 14003 |
| Micro Scissors b | Ted Pella | 1347 |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 |
| DiI | Invitrogen | D-383 |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 |
Referências
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