Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie
Summary
Demonstreren we een<em> In vivo</em> Elektroporatie protocol voor transfecteren enkele of kleine clusters van retinale ganglioncellen (RGC) en andere retinale celtypes in postnatale muizen over een breed scala aan leeftijden. De mogelijkheid om label en genetisch te manipuleren postnatale RGC<em> In vivo</em> Is een krachtig hulpmiddel voor ontwikkelings-studies.
Abstract
De doelgerichtheid en verfijning van RGC projecties naar de middenhersenen is een populaire en krachtige modelsysteem voor het bestuderen van hoe nauwkeurig patronen van neurale verbindingen vormen tijdens de ontwikkeling. Bij muizen zijn retinofugal projecties gerangschikt in een topografische wijze en vorm eye-specifieke lagen in de laterale geniculate Nucleus (dLGN) van de thalamus en de Superior colliculus (SC). De ontwikkeling van deze precieze patronen van retinofugal projecties heeft meestal onderzocht door middel van etikettering populaties van RGC met fluorescerende kleurstoffen en tracers, zoals mierikswortelperoxidase 1-4. Maar deze methoden zijn te grof om inzicht te krijgen in de ontwikkeling veranderingen in de individuele RGC axonale prieel morfologie, die de basis van retinotopische kaart formatie. Ze hebben ook niet mogelijk voor de genetische manipulatie van RGC.
Onlangs is elektroporatie uitgegroeid tot een effectieve methode voor het verstrekken van nauwkeurige ruimtelijke en temporele controle voor de levering van geladen moleculen in het netvlies 5-11. Huidige netvlies elektroporatie protocollen niet mogelijk voor genetische manipulatie en het traceren van retinofugal projecties van een enkele of een kleine cluster van RGC in postnatale muizen. Er is betoogd dat postnatale in vivo elektroporatie niet is een levensvatbare methode voor transfecteren RGC, omdat de etikettering rendement is extreem laag en eist daarom dat gericht op embryonale leeftijd bij RGC voorouders zijn differentiatie en proliferatie 6 ondergaan.
In deze video beschrijven we een in vivo electroporatie protocol voor gerichte toediening van genen, shRNA, en fluorescerende dextranen voor muriene RGC postnataal. Deze techniek biedt een rendabele, snelle en relatief makkelijk platform voor een efficiënte screening van kandidaat-genen die betrokken zijn bij verschillende aspecten van neurale ontwikkeling, met inbegrip axon retractie, vertakking, lamineren, regeneratie en synapsvorming in verschillende stadia van ontwikkeling circuit. In het kort beschrijven we hier een waardevol hulpmiddel die verder inzicht verschaft in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen zintuiglijke kaart ontwikkeling.
Protocol
Discussion
In deze video zien we een in vivo electroporatie protocol dat resulteert in de etikettering van enkele of kleine clusters van retinale neuronen in postnatale muizen met DNA-constructen die coderen voor fluorescerende eiwitten. Kleine clusters van fluorescent gelabelde RGC projecties naar de dLGN en SC gereproduceerd soortgelijke projectie patronen als eerdere studies met behulp van RGC etikettering met lipofiele kleurstoffen, wat aangeeft dat elektroporatie niet interfereren met de normale RGC axon prieel verfi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De pCAG-gapEGFP plasmide was een geschenk van dr. S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato plasmide was een geschenk van dr. M. Feller (Berkeley, CA). Wij danken dr. Edward Ruthazer voor het suggereren het gebruik van een twee-plasmide strategie voor enkele cel etikettering en Anne Schohl (Montreal, QC) voor de validatie van de twee-plasmide Cre / loxP strategie in pilot-studies en Crair lab leden voor technische ondersteuning. Ondersteund door R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) en NIH P30 EY000785 (MC).
Materials
| Materials | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Electrical Stimulator | Grass Instruments | Model S4 |
| Oscilloscope | Agilent | Model 54621A |
| Audio monitor | Grass Instruments | Model AM8B |
| Puller | Sutter Instruments | Model P-97 |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments | 14003 |
| Micro Scissors b | Ted Pella | 1347 |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 |
| DiI | Invitrogen | D-383 |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 |
Referências
- Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields. Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).
- McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O’Leary, D. D. Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development. Neuron. 40, 1147-1160 (2003).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse. J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).
- Jaubert-Miazza, L. Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse. Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Analysis of gene function in the retina. Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
- Ishikawa, H. Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode. Gene Ther. 12, 289-298 (2005).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T., Yuste, R., Konnerth, A. In vivo time- lapse imaging of neuronal development. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 191-204 .
- Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. Nonviral ocular gene transfer. Gene Ther. 12, 843-851 (2005).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).
- Plas, D. T. morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse. J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).
