Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon
Summary
Bir göstermektedir.<em> In vivo</em> Retina ganglion hücrelerinin (RGCs) ve geniş bir yaş aralığı üzerinde postnatal farelerde diğer retinal hücre tipleri, tek ya da küçük kümeler transfecting elektroporasyon protokolü. Etiket ve genetik postnatal RGCs işlemek için yetenek<em> In vivo</em> Gelişim çalışmaları için güçlü bir araçtır.
Abstract
Ortabeyin RGC projeksiyonlar hedefleme ve arıtma gelişimi sırasında nöral bağlantı formunun ne kadar hassas desenler çalışmak için popüler ve güçlü bir model sistem. Farelerde, retinofugal projeksiyonlar, talamus ve Superior Colliculus (SC) Lateral genikulat Nucleus topoğrafik bir şekilde ve form göz belirli katmanlarına (dLGN) düzenlenir. Retinofugal projeksiyonlar bu kesin desen gelişimi genellikle horseradish peroksidaz 1-4 gibi floresan boyalar ve izleyiciler ile RGCs nüfusu, etiketleme çalışılmıştır. Ancak, bu yöntemler retinotopic harita oluşumunun temelinde bireysel RGC aksonal çardak morfolojisi gelişimsel değişiklikler içgörü sağlamak için çok kaba. Ayrıca RGCs genetik manipülasyon için izin vermez.
Son zamanlarda, elektroporasyon 5-11 retina içine yüklü moleküllerin teslimat için mekansal ve zamansal hassas kontrolü sağlamak için etkili bir yöntem haline gelmiştir. Şu retina elektroporasyon protokolleri genetik manipülasyon için izin ve doğum sonrası farelerde RGCs, tek ya da küçük bir kümenin retinofugal projeksiyonları izleme yok. In vivo elektroporasyon postnatal RGCs transfecting etiketleme verimliliği son derece düşük olduğu için uygulanabilir bir yöntem değildir ve bu nedenle embriyonik yaşta RGC atalarıdır farklılaşması ve proliferasyonu 6 geçiren hedef gerektirir öne sürülmüştür .
Bu video için in vivo elektroporasyon protokolünde hedeflenen gen teslimat, shRNA ve postnatal fare RGCs floresan dextrans açıklar. Bu teknik, dallanma, laminasyon, yenilenme ve devre geliştirme çeşitli aşamalarında sinaps oluşumu, akson retraksiyon da dahil olmak üzere sinirsel gelişimi çeşitli yönleri yer alan aday genlerin etkin bir tarama için hızlı, etkin maliyetli ve nispeten kolay bir platform sağlar. Özet olarak biz burada duyusal harita gelişiminin altında yatan moleküler mekanizmaları içine daha fazla bilgi sağlayacak değerli bir araç açıklar.
Protocol
Discussion
Bu video in vivo elektroporasyon protokol gösteren floresan proteinleri kodlayan DNA yapıları ile doğum sonrası farelerde retinal nöronların tek ya da küçük kümeler etiketlenmesi ile sonuçlanır. Önceki çalışmalarda bu elektroporasyon normal RGC akson çardak arıtma karışmadı gösteren, lipofilik boyalarla RGC etiketleme kullanarak dLGN ve SC floresan etiketli RGC projeksiyonları Küçük kümeler benzer projeksiyon modelleri çoğaltılamaz. Biz, normal ve kesintiye görsel haritalar ile ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCAG gapEGFP plazmid Dr. S. McConnell (Stanford, CA) bir hediye oldu. pCAG-tdTomato plazmid Dr. M. Feller (Berkeley, CA) bir hediye oldu. Biz, teknik destek için pilot çalışmalar ve Crair laboratuvar üyeleri iki plazmid Cre / loxP strateji doğrulamak için tek bir hücre etiketleme ve Anne Schohl (Montreal, QC) için iki plazmid strateji kullanımı öneren Dr. Edward Ruthazer teşekkür ederiz. R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) ve NIH P30 EY000785 (MC) ile desteklenir.
Materials
| Materials | Company | Catalog number |
|---|---|---|
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Electrical Stimulator | Grass Instruments | Model S4 |
| Oscilloscope | Agilent | Model 54621A |
| Audio monitor | Grass Instruments | Model AM8B |
| Puller | Sutter Instruments | Model P-97 |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments | 14003 |
| Micro Scissors b | Ted Pella | 1347 |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 |
| DiI | Invitrogen | D-383 |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | D4551 |
Referências
- Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields. Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).
- McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O’Leary, D. D. Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development. Neuron. 40, 1147-1160 (2003).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse. J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).
- Jaubert-Miazza, L. Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse. Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Analysis of gene function in the retina. Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
- Ishikawa, H. Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode. Gene Ther. 12, 289-298 (2005).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T., Yuste, R., Konnerth, A. In vivo time- lapse imaging of neuronal development. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 191-204 .
- Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. Nonviral ocular gene transfer. Gene Ther. 12, 843-851 (2005).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).
- Plas, D. T. morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse. J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).
