细胞毒性实验来衡量HIV感染的细胞自然杀伤细胞裂解反应是有限的靶细胞的纯度。我们这里展示的高度纯化的HIV – 1感染的主要T细胞爆炸的人口利用HIV – 1病毒的能力,向下调整的CD4隔离。
自然杀伤(NK)细胞病毒感染的细胞的先天免疫反应的一个重要组成部分。重要的是了解NK细胞识别并裂解HIV – 1感染细胞,因为任何aberrancy确定对HIV感染的细胞,NK细胞功能,可能会导致治疗,会提高其杀伤活性的能力。有必要使用的靶细胞,而再感染的T细胞系的细胞毒性检测艾滋病毒感染的主要T细胞爆炸。 T细胞系,即使没有感染,很容易受到NK细胞裂解。此外,它是必要的,使用自体的主要细胞,以防止主要组织相容性复合体类之间的目标和效应细胞,这将导致在裂解我错配。早期研究评估原发性HIV感染的细胞NK细胞的杀伤反应没有表现出明显的杀伤感染细胞 1,2 。然而,艾滋病毒感染的主要作为在NK细胞功能分析的靶细胞的T细胞已困难的,因为污染未受感染的细胞的存在。捐助者NK细胞功能的变化可能是由于样品之间的NK细胞杀伤的变化将导致这种不一致的感染细胞未受感染的细胞比例。因此,将有利于感染的细胞人口与纯化的工作,以标准化的效应为目标的实验 3,4之间的细胞比例。在这里,我们展示了HIV – 1病毒的能力优势,在受感染的细胞和商业套件的可用性向下调节CD4 +除去死亡或濒临死亡的细胞3-6高度纯化的HIV – 1感染细胞的人口隔离。纯化后的感染主要的T细胞可以被用来作为爆炸目标,在任何一个脱粒或效应人口5-7用纯化NK细胞的细胞毒性检测。使用在脱粒检测NK细胞效应评估NK细胞的能力, 释放 8所谓的“杀伤冲剂”的专门溶酶体裂解内容。通过与CD107a,溶酶体膜蛋白,成为NK细胞表面杀伤颗粒融合到质膜表达对一个荧光标记的抗体染色,我们可以判断在反应靶细胞识别degranulate NK细胞的百分比。另外,NK细胞的催化活性,可评估细胞毒性实验, 允许 51铬释放从内NK细胞的存在的靶细胞裂解的靶细胞比例的决心。
正确完成后,在本协议中所述的检测应提供的NK细胞的能力degranulate对和裂解HIV – 1感染的细胞(见图5)的代表图片。在艾滋病毒感染的细胞和NK细胞的艾滋病毒感染的细胞裂解NK细胞脱颗粒应该是成正比10。两个NK细胞功能分析来衡量HIV感染的细胞的细胞毒性反应的可靠的结果是依赖于高度纯化的NK细胞以及高度纯化的人口受感染的细胞的隔离。经纯化的NK细胞和HIV – 1感染细胞的关键是实现一个相当准确的效应靶细胞比。同样,去除死亡和细胞凋亡的目标细胞群是重要的前51铬标签或与效应细胞的培育,51班正在经历死亡或凋亡细胞的存在,在同位素标记的步骤凋亡的细胞可能是由内在将导致高的自发释放,并会扭曲%计算具体裂解。此外,死亡或凋亡细胞的存在可能引发NK细胞脱颗粒,导致CD107a表达异常高的水平。精确移液是必要的,取出时无细胞上清液中NK细胞和靶细胞孵育 51铬释放试验,从每个重复删除上清量的差异会导致在高标准的偏差。可以修改这些协议,以评估具体的NK细胞受体的作用,在事先与对立抗体的特定受体或配体6,11共培养孵化的效应或目标触发NK细胞的艾滋病毒感染的细胞裂解。细胞因子治疗(如IL – 2,IL – 15)的NK细胞可用于评估刺激的12个NK细胞的功能。同样,抗体依赖性细胞毒性试验,可能会使用这些协议的执行。抗- HIV抗体(如抗- gp120的),可以增加识别的靶细胞,NK细胞低亲和力Fc 受体 CD16 13。这些检测,虽然成立来衡量HIV感染的细胞NK细胞的细胞毒性反应,也可以被修改来衡量的NK细胞的艾滋病毒感染的细胞识别后产生细胞因子的能力。虽然我们在本议定书中所描述的使用在体外感染的细胞作为靶细胞,我们最近所描述的靶细胞的感染艾滋病毒的患者代。这需要隔离的CD4 +细胞扩张过了两个星期的期间,在白细胞介素-2 11的存在有丝分裂原刺激T细胞。扩张后的两个星期内,在这篇文章中所述的协议,用于隔离的靶细胞。
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Vaccutainer Tubes (Sodium Heparin) | Becton Dickenson | 367874 | ||
RosetteSep CD4+ T-cell Isolation Kit | StemCell Technologies | 15062 | ||
CMF PBS | Hyclone | SH30256.01 | ||
FBS | Hyclone | 10437-028 | ||
Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | ||
RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | ||
Penicillin / Streptomycin | Hyclone | SV30010 | ||
L-glutamine | Cellgro | 25-005-Cl | ||
T-cell Expansion Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-441 | ||
CMF HBSS (1x) | Hyclone | SH30588.01 | ||
0.5M EDTA | 46-034-Cl | |||
NK Cell Negative Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-657 | ||
IMDM | Gibco | 12440-046 | ||
CD4+ Positive Isolation Kit | Invitrogen | 113.31D | ||
Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | ||
Polybrene | Santa Cruz | sc-134220 | ||
CD3 PacificBlue | Becton Dickenson | 558117 | ||
CD14 PacificBlue | Biolegend | 325616 | ||
CD20 PacificBlue | Biolegend | 302328 | ||
CD56 APC | Biolegend | 318310 | ||
CD69 PE | Becton Dickenson | 555531 | ||
CD107a FITC | Becton Dickenson | 555800 | ||
51Chromium | Perkin Elmer | NEZ030002MC | ||
Gamma Counter Tubes | Perkin Elmer | 1270-401 | ||
2470 Automatic Gamma Counter | Perkin Elmer | 2470-0050 | ||
FACS Diva | Beckton Dickenson | 643629 | ||
FlowJo | TreeStar | FJ-9-1YR |