BALB / C脑组织中的高灵敏度检测5 - hydroxymethylcytosine
Summary
EpiMark 5 HMC和5 – MC分析套件，可用于分析和定量内SPE太平洋轨迹的5 – 甲基胞嘧啶和5 hydroxymethylcytosine。该试剂盒区别于5 HMC 5 – MC除了通过对葡萄糖的酶，利用β-葡萄糖（T4 – BGT）反应羟基组的5 HMC。当5 HMC在CCGG背景下发生，这种修改裂解MSPI网站转换成非裂解网站。
Abstract
DNA羟甲基化是一个久负盛名的DNA修饰，但最近已成为表观遗传学研究的重点。哺乳动物的DNA酶修饰的5 个碳的位置，胞嘧啶（C）残留5 – MC，他们主要在CpG二核苷酸中。 5 – MC是服从酶氧化酶的春节家庭，这被认为是涉及发育和疾病5 – HMC。目前，5 HMC的生物作用是不完全理解，但产生了很多的利益，由于其作为生物标志物的潜力。这是由于几个开创性的研究确定，在小鼠胚胎干（ES）和神经细胞的5 – hydroxymethylcytosine。
研究技术，包括重亚硫酸盐测序方法，是无法容易分辨5 – MC和5 HMC。几个协议存在，可以衡量全球基因组中的5 – hydroxymethylcytosine的金额，包括液相色谱与质谱分析或薄层色谱法从基因组DNA消化的单核苷，的。抗体，目标5 – hydroxymethylcytosine也存在，可用于点杂交分析，免疫荧光，或羟甲基化的DNA沉淀，但这些抗体不具备单基地resolution.In此外，分辨率取决于免疫沉淀的DNA的大小和微阵列实验，取决于探头设计。由于它是未知的5 hydroxymethylcytosine在基因组的表观遗传调控中的作用存在的确切位置，新技术，它可以识别位点的具体羟甲基。 EpiMark 5 HMC和5 – MC分析套件提供了一个区分在特定位点的这两个修改的解决方案。
EpiMark 5 HMC和5 – MC分析套件是为5 – 甲基胞嘧啶和5 hydroxymethylcytosine在一个特定的DNA位点的识别和定量分析的简单和可靠的方法。这种酶的方法，利用同裂酶MSPI和HpaII差甲基化的敏感性，在一个简单的3步协议。
被视为与T4 – BGT感兴趣的基因组DNA，加入葡萄糖moeity 5 hydroxymethylcytosine。这种反应是序列独立的，因此所有5 – HMC将glucosylated;未修改或5 – MC含有DNA不会受到影响。
这glucosylation是随后由酶切。 MSPI和HpaII认识到相同的序列（CCGG），但不同的甲基化状态很敏感。 HpaII切割只有一个完全未修改的网站：任何修改或者胞嘧啶块裂解（5 – MC，5 HMC或5 ghmC）。 MSPI识别和切割5 – MC和5 HMC，但不是5 ghmC。
该协议的第三部分是通过PCR的轨迹审讯。可用于输入DNA低至20纳克。实验（glucosylated和消化）和控制（模拟glucosylated和消化）的目标与侧翼利益CCGG网站（100-200 BP）引物的DNA进行扩增。如果中央人民政府网站包含5 hydroxymethylcytosine，带检测glucosylation和消化后，但不能在非glucosylated控制反应。实时PCR将在这个特殊的网站是多少hydroxymethylcytosine逼近。
在这个实验中，我们将分析终点PCR方法在小鼠BABL / C大脑样本5 hydroxymethylcytosine金额。
Protocol
Discussion
设立这个实验时，有几个关键的事情要考虑。首先，它是非常重要的基因组DNA glucosylation收益来完成。 T4 – BGT序列特异性是不为人所知，并且，它似乎已经为基材序列别无选择。因此，在某些情况下，潜伏期较长时间，可能是必要的。其次，MSPI和HpaII消化必须是完整的，以避免背景信号。对于这些限制性内切酶，我们推荐的4个小时的潜伏期的时间，但不完全卵裂是观察时，可以进行较长的孵化。第三，输入DNA量可以调整取决于可用性，自20农工商超市的DNA可用于终点PCR。最后，我们建议使用提供的对照DNA，这可能是基因组DNA的同时运行5 – MC和5 – HMC量化。
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sriharsa普拉丹，香侬 – 莫雷金尼，恒庆钦Jurate Bitinaite，郑瑜，皮埃尔奥利维尔Esteve，Romualdas Vaisvila，史蒂芬五雅各布森的实验室，加州大学洛杉矶分校。部分支持这项工作是由美国国立卫生研究院1R44GM095209 – 01。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit | New England Biolabs | E3317 | ||
| Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest | Custom per experiment; provided by user | |||
| LongAmp® Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0323 | ||
| dNTPs | New England Biolabs | N0447 | ||
| molecular biology grade water |
Referências
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