2 광자 현미경을 사용하여 감염된 폐의 Neutrophils에 의해 Phagocytosis와 NET - 형성의 직접 관측

1. 감염 곰팡이 Aspergillus fumigatus (변형 ATCC 46645)을 부어 conidia가와 보충 RPMI 1640 (Biochrom AG, 베를린, 독일)의 사전 배양에 의해 생성됩니다 5% FCS (V / V). 2×10 7 휴식 conidia 5 ML 매체에 resuspended과 6 잘 조직 배양 플레이트 (TPP AG; Trasadingen, 스위스, 카탈로그 # 92006)에 incubated 아르 37 7h에 대한 ° C. 6 – 음에 잘 포함하는 각 Aspergillus에, 붓기 기간에 따라, 포자는 찬란 calcofluor 흰색 주식 솔루션 (DMSO에서 [25 MG / ML] 시그마 알드리치, Deisenhofen, 독일, 카탈로그 # F3543) 10 μl를 추가하여 레이블 아르 판, 50 μg / ML RPMI의 최종 calcofluor 농도에 도달. 부드러운 혼합 후, 포자는 37 ° C.에서 추가 15 분 incubated 아르 다음 단계에서는 포자는 70 μm의 셀 스트레이너 (BD Biosciences, 하이 델베르크, 독일)를 통해 여과하여 수확하고 있습니다. 10 ML PBS (실온에서 5 분 900xg에서 원심 분리기)를 한 번 세척 후 펠렛 2 ML PBS와 노이 바 우어 챔버와 계산에 의해 결정 부어 conidia의 총 숫자 resuspended 있습니다. 마지막으로 포자 현탁액을 실온에서 5 분 900xg에서 다운 소용이며, 뜨는 신중하게 제거하고, 펠릿 100 μl PBS 당 1×107 포자의 최종 농도 resuspended입니다. 감염, 포자 용액 100 μl는 여성 마우스 (C57/BL6, 오래된 8~10주, 할렌, 독일)에 intratracheally 적용됩니다. neutrophils뿐 아니라 관찰하는 경우, 라이 소 자임의 promotor 1 아래 EGFP를 들고리스 – EGFP 마우스의 사용이 권장됩니다. 150 μl Ketamin / Rompun 솔루션 (Inresa Arzneimittel GmbH를, 프라이 부르크, 독일 (Ketamin)와 바이엘 바이탈 GmbH를, 레버쿠젠, 독일 (Rompun), 1 ML Ketamin [50 MG / ML]의 단일 IP 분사와 함께 동물을 anesthetizing로 시작 + 0.5 ML Rompun [2 %] + 3.5 ML 살균 NaCl [0.9 %]). 오분 후 anesthetized 마우스는 삽관법 (보충 그림 1)을 촉진하기 위해 진입로를 (즉, sloped 표면)에 이빨하여 탄성 밴드와 함께 해결할 수 있습니다. 포셉를 사용하여 혀는 한쪽과 22G 내재의 정맥 카테 테르 (B. 브라운 AG, Melsungen, 독일, Vasofix Braunüle) 부드럽게 구스 넥 램프와 영구적인 조명 아래 기관에 삽입이 될 수도 가져온 것입니다. 카테 테르의 성공적인 삽입은 기계적 인공 호흡의 빈도와 동물의 흉부 정기적으로 운동을 관찰하여 확인됩니다. 성공 삽관법이 확정되면, 100 μl 포자 현탁액을 100 μl micropipette를 사용하여 적용됩니다. 이 볼륨은 1-2 미국에서 추가 도움없이 동물에 의해 흡입해야합니다 폐 내부의 곰팡이 입자의 향상된 배포는 기계 분당 250 호흡 속도 300의 흡입 볼륨에서 작은 동물 인공 호흡기 (MiniVent, 휴고 삭스, 3 월 Hugstetten, 독일) 2 분 동안 감염된 동물을 환기에 의해 이루어집니다 호흡 당 μl (보충 그림 2). 감염 동물들은 케이지에 반환하고 다시 외래 때까지 5 분마다 관찰 후. 생쥐는 다음과 부화 기간 동안 통증이나 고통의 증거를 보여주지 않습니다. 2. 폐 준비 포자와 감염 후 7 H는, 동물의 과다에 의해 euthanized이다 isoflurane (백스터 GmbH를, Unterschleiβheim, 독일) 움직임과 호흡이 30 초 이상 정지 때까지. 이것은 다음 임상 사망 보장 및 시각화와기도와 폐 액세스할 수 있도록 보조 방법으로 thoracotomy옵니다. 그러면 가슴이 조심스럽게 폐암과 상부 호흡기 트랙트을 폭로 열립니다. 그런 다음 다른 22G 내재의 정맥 카테 테르는 노출 후두개부터 기관에 삽입됩니다. 이 가느다란 관 통해 폐는 1 ML Omnifix 주사기 (B. 브라운)을 사용하여 한 ML 미리 예열 낮은 용융 아가로 오스 (2 % W / V, Promega, 만하임, 독일)로 가득합니다. 즉시 폐이 가득 같은 기관은 재봉 스레드의 짧은 조각으로 떨어져 연결되어 있으며, 전체 동물 4에서 냉장고에 넣고 ° C.를 15 분 후, 아가로 오스가 확정되면, 전체 폐는기도에서 시작 excised 수 있습니다. 날카로운 지적 가위를 사용하여, 오른쪽 폐 엽이 이후에 제거, 바닥 표면은 간단히 조직 종이에 건조 후 전체 엽은 vibratome (캠덴 계측기, 영국, 752M Vibroslice의 준비 블록에 붙어있다 ) 고정 (칼 로스 GmbH를, 칼스 루에, 독일, Roti – 콜 1) 조직 접착제 한 방울을 사용하여. 1 분 후, 블록이 미리 냉장 (4 ° C) PBS으로 가득합니다 vibratome의 커팅 챔버에 설치됩니다. vibratome는 중형 진동 (10 최대 5 밖으로.) 또한 중간 속도 (5 밖으로 10 맥스.) 이러한되는 수평 단면으로 설정됩니다폐이 생산됩니다. 기관의 위쪽 절반이 다음은 병렬 나일론 스레드의 집합이 적용되는 자수 성가 플랫 와셔 (1cm 내경)과 거꾸로 및 고정되는 작은 플라스틱 페트리 접시 (5cm 직경)로 전송 분리 각 1mm (보충 그림 3). 마지막으로 페트리 접시 10 ML PBS는 DNA 염색 Sytox 오렌지 5 μm의의 최종 염료 농도의 결과 [5 MM] (Invitrogen, 독일)의 10 μl와 보충으로 가득합니다. 3. 2 – 광자 레이저 현미경 폐 샘플을 포함하는 페트리 접시는 다음 버퍼 ° C의 온도 센서 조절 히터 (보충 그림 4)에 의해 37 예열 수 있도록 현미경 목표 아래에 설치됩니다. 2 광자 현미경은 다음 20xNA1.0 물 수영 렌즈 (자이스 혈구, 예나, 독일)가 장착된 수직 Axio 심사관 무대에서 자이스 혈구 LSM 710 NLO 현미경을 사용하여 전체 절단 표면을 통해 수행됩니다. 이미징 들어, 섹션 따라 서로 다른 영역은 녹색 (530 나노미터)과 빨간색 (580 NM) 형광뿐만 아니라, 두 번째 고조파 세대 (SHG) 신호와 검출 800 NM의 조명 파장을 사용하여 400 μm의 깊이로 스캔 외부 비 descanned 탐지기 (NDD)와 블루 calcofluor 형광 (400-470 nm의 방출에서). 2 – D 이미지와 시간 경과 영화 (1 이미지를 모든 50-10초) 게다가, 단일 또는 반복적인 3 차원 사진 스택은 이후 사용 voxel 렌더링하거나 하나의 확장 초점을 이미지 또는 4 – D 데이터 (시간이 지남에 따라 3D)으로 렌더링할 수 다른 소프트웨어 패키지. 이 미세한 설정은 공중 병원균의 다양한 항목 포트를 구성 같은 거대한 면역 관련입니다, 거의 손상되지 환경에서 세포 행동의 관찰하실 수 있습니다. 세포 운동성, phagocytosis 및 곰팡이 Aspergillus fumigatus와 감염에 따라 내생 neutrophils에 의해 NET 생산 쉽게 현장 조건에서 이러한하에 조사 수 있습니다. 4. 대표 결과 완료하면 제대로 영상 2를 생성합니다 – 또는 3 – 컬러 슬라이드이나 영화. 색채가 사후 처리 절차 완료되므로 자유롭게 적응력이다하지만, 우리는 일반적으로 상대적인 채널에 감지 염료 / 신호의 자연 색상을 반영하는 색칠 구성표를 선택합니다. 따라서 Sytox 염료가있는 경우, EGFP – 라벨이 세포가 녹색으로 물들어 있으며, 빨강, 균류뿐만 아니라 SHG 신호가 파란색으로 표시됩니다에 묘사된하고 있습니다. 첫 번째 예제에서 (그림 1) 푸른 SHG 신호는 조직이 아닌 감염된 폐의 섬유 붉은 Sytox 신호 폐 상주 세포의 핵에 의해 생산되는 vibratome 공개 몫을 모습. 모두, 폐포 구조뿐만 아니라 곰팡이 대중이 파란색으로 나타납니다 어디에 핵 및 그물이 빨간색으로 물들어있는 동안 두 번째 예제 (그림 2)에 감염된 폐는, 표시됩니다. 세 번째 예제 (그림 3) 청색과 적색 구조 이외에 녹색 neutrophils도 볼 수리스 – EGFP 형질 전환 동물에서이다. neutrophils 및 시간 저속 시퀀스에서 개별 곰팡이 요소들의 phagocytosis의 마이 그 레이션은 보충 영화에 표시됩니다. 그림 1. 2 컬러가 아닌 감염된 폐 슬라이스의 모양은 2 광자 현미경. 폐 슬라이스가 아닌 감염 C57/BL6 마우스 준비와 프로토콜에서 설명한대로 몇 군데했다. 폐포 조직 구조 (A)의 SHG 신호가 여기에 제시 세포 핵의 Sytox 신호가 폐암 슬라이스 (B), 두 채널 (C)의 오버레이의 준비 기간 동안 오픈 했네요. (C)의 박스 영역 (D)의 확대 볼 수 있습니다. 위 폐의 호흡 활성 영역 내에서 명확하게 폐포 조직에 비해 단면 폐의 하단에있는 섬유 조직을 유의하시기 바랍니다. 그림 2. 2 컬러 Aspergillus 감염 야생 형식 동물의 폐 슬라이스 2 광자 현미경의 모습. 7 H를 감염 C57/BL6 마우스 폐 슬라이스 A.와 함께하기 전에 fumigatus는 준비하고 프로토콜에서 설명한대로 몇 군데했다. 표시 통합 곰팡이 구조와 SHG 폐포 조직 (A), DNA의 그물의 Sytox 신호뿐만 아니라 세포 핵은 폐 슬라이스 (B)의 준비 기간 동안 오픈 컷, 두 채널의 오버레이 (C)입니다 . (C)의 박스 영역 (D)의 확대 볼 수 있습니다. 주의, 곰팡이 대중, 폐포 및 NET – 구조의 명확 고유한 영역이 글자 각각 F, A와 N과 함께 표시됩니다. 그림 3. 3 컬러 Aspergillus 감염리스 – EGFP 동물의 폐 슬라이스의 모양은 2 광자 현미경.리스 – EGFP 마우스의 폐 슬라이스 함께 전에 7 H 감염A. fumigatus는 준비하고 프로토콜에서 설명한대로 몇 군데했다. 표시 통합 곰팡이 구조와 SHG 폐포 조직 (파란색), 세포 핵 및 그물 (적색)의 Sytox 신호뿐만뿐만 아니라 수많은 neutrophils (녹색)입니다. 보충 그림 1. 삽관법에 대한 마우스 고정가. Ketamin / Rompun 마취 동물은 22G 내재의 정맥 카테터와 삽관법을 촉진하기 위해서는 치아에서 탄성 밴드와 함께 고정됩니다. 보충 그림 2. 기계식 마우스 환기가. intubated 마우스는 100 μl PBS에 resuspended 1×10 7 포자의 그것 응용 프로그램에 의해 감염됩니다. 폐 내부의 곰팡이 입자의 향상된 배포는 기계식 작은 동물 인공 호흡기로 감염된 마우스를 환기에 의해 이루어진다. 보충 그림 3. 폐 엽 고정가. 오른쪽 폐 엽의 준비 후 기관은 병렬 나일론 스레드의 집합에 의해 덮여 있습니다 실험실 만든 평면 와셔를 사용하여 페트리 접시에서 해결되었습니다. 보충 그림 4. 2 – 광자 이미징 설치. 오른쪽 폐 엽을 포함 페트리 접시는 DNA 염색 Sytox 오렌지를 추가 후 2 광자 현미경 난방 매트에 설치됩니다. 보충 동영상 :. 균류와 감염 후 살아있는 폐 슬라이스 7 H 2 – 광자 현미경 시간 경과로 볼 수로 마이 그 레이션 및 Aspergillus 감염 폐의 곰팡이 요소를 phagocytosing Neutrophils Neutrophils은 녹색, 곰팡이 요소이며, SHG은 파란색이며, 세포 핵으로 뿐만 아니라 NET – 구조는 빨간색으로 그려져있다. 실험의 실제 시간은 오른쪽 하단에 표시됩니다. 스케일 바는 50 μm의를 묘사. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오