Измененный мышиных эмбриональных стволовых клеток основанных Пробирной для Количественная Кардиогенный эффективность индукционной

1. Эмбриональные орган (EB) образование использованием 96-круглым дном и микротитровальных пластин Расти ЭС клетках мыши в 10 см клеточных культур пластин с ЭСК мыши среде, дополненной LIF. При ЭС клетки готовы к использованию (как правило, на 50-70% слияния), удалите ES СМИ и промыть клетки один раз с 5 мл стерильной PBS. Добавить 2 мл 0,05% трипсин / ЭДТА на каждой пластине и инкубировать пластин при 37 ° С в течение 3 ~ 5 минут, Quench трипсина ЭДТА 3 мл СМИ ES. Передача клетки 50мл сокола труб и спина при 1000 оборотов в минуту в течение 3 минут. Удалить супернатант, и ресуспендируют осадок клеток с желаемым количеством EB СМИ. Граф номер ячейки и разбавленных клетки до 5 × 10 3 клеток / мл в EB СМИ. Используйте многоканальную пипетку, чтобы добавить 100 мкл EB средах, содержащих клеток в каждую лунку 96 – круглый луночных микротитровальных. Место 96 – круглый луночных микротитровальных в инкубаторе. 2. Определение важнейших временные окна из ключевых сигнального пути (ы) для cardiogenesis Добавить модуляторы конкретных сигнальных путей и управления транспортным средством в каждую лунку 96-луночного микротитровальных чашек, содержащих стволовые клетки в различные моменты времени, например, день 0, день 1, день 2, день 3 и 4-й день и т.д. Половина скважин в каждом 96 -луночного планшета (48 скважин) используются для каждого момента времени начала лечения. Промыть модуляторы, изменив EB СМИ за каждые 48 скважин на различных пунктов остановки времени. Например, чтобы получить два дня лечения ЭС клетки, начиная со дня 0, промыть модуляторы в день 2. Для какого-либо лечения более 48 часов, изменение EB среде с свежим модуляторы каждые два дня до желаемой точки остановить время. Изучить EB сокращения под микроскопом после 7-й день. Оценка скважин с контрагентами ЭТ как позитивные, чтобы получить процент заражения ЭТ для каждого различные курсы время лечения. Критических точек времени для cardiogenesis ES являются временными рамками, в которых содержались высокий процент заражения ЭТ лечиться сигнализации модуляторы по сравнению с управления транспортным средством. 3. Проверка временных окон сигнализации для cardiogenesis в ЭТ из висят капли Подготовка чашки Петри с добавлением 3-4 мл PBS, чтобы предотвратить испарение. Выполните шаги 1,1 ~ 1,5 подготовить ЭС клеток в 2.5×10 4 клеток / мл конечного плотность клеток. Вылейте смесь в ячейки бактериальных блюдо для быстрого доступа. Использование многоканальной пипетки внести 20 мкл капли (содержащий около 500 клеток) на перевернутую крышку. Не допускать отдельные капли на ощупь. Вообще одна крышка может поместиться до 80 капель. Переверните крышку над блюдом содержащие PBS. Инкубируйте в течение 24 часов или 48 часов, чтобы позволить Б. образования в инкубаторе. Запивать EB формируется из висят капли из каждой крышке с 3 мл среды EB и бассейн 2 крышки ЭТ к новой чашки Петри. Добавить EB СМИ, чтобы общий объем 10 мл. Передача ЭТ в виде суспензии на 0,2% желатин покрытием 6-луночных на 4 день. В целом 30 ЭТ передаются в каждую лунку. Добавить EB средств массовой информации, чтобы получить 2 мл конечного объема для каждой скважины. Инкубируйте сигнализации модуляторы на период времени идентифицированы 96-луночного экспериментов пластины. Соблюдайте EB сокращения под микроскопом за днем ​​7 и cardiogenesis может быть в дальнейшем характеризуется RT-PCR, иммунной и других, если это необходимо.