Kardiyojenik İndüksiyon Verimlilik miktarının için modifiye Fare Embriyonik Kök Hücre tabanlı Testi
Summary
Biz bir fare ES hücre tabanlı testin Wnt / β-katenin ve kardiyojenik indüksiyon sırasında BMP sinyal aktivasyonu için kritik zaman pencere tanımlamak için kullandıklarını açıklarlar. Bu yöntem, güvenilir bir kardiyojenik verimliliği rakamlarla standart bir platform sağlar ve diğer hücre soylarının çalışma için geçerlidir.
Abstract
Tuşa birden fazla sinyal yollarının zamansal ve mekansal yönetmelikle pluripotent kök hücre farklılaşması sıkı kontrol edilir. Anlayışı engellerden biri farklılaşma verimliliği önemli sinyal olayların değişiklikler arasındaki ilişkiyi çeşitli yöntemler olmuştur. Biz burada (ES), bir fare embriyonik kök hücre temelli tahlil Wnt / β-katenin ve kardiyojenik indüksiyon sırasında BMP sinyal aktivasyonu için kritik zaman pencere tanımlamak için kullandıklarını açıklarlar. 96-plaka formatında embriyonik organları (EBS) sözleşme için puanlama, biz hızlı kardiyojenik verimliliğini ölçmek ve Wnt / β-katenin ve belirli modülatör tedavileri aşağıdaki bir zaman içerisinde BMP sinyal aktivasyonu için çok önemli zaman belirlemek. Burada özetlenen başlıca kalp indüksiyon yalnız bunlarla sınırlı değildir, ve diğer pek çok hücre soylarının çalışma yönünde uygulanabilir. Buna ek olarak, 96-well formatında, daha yüksek verimlilik, daha sofistike deneysel hipotezleri test etmek için izin verecek şekilde otomatik tahlil olarak geliştirilen potansiyeline sahiptir.
Protocol
Discussion
Asılı damla yöntemi, EB oluşumu için ve in vitro ayrımında kullanılan geleneksel bir yöntem olmuştur. Ancak, zahmetli ve lojistik endişeleri nedeniyle deneysel esnekliği sınırlar. Deneyci beceri asılı damla kadar başarılı EB oluşumu ve manipülasyon için çok önemli olduğu gibi aynı şekilde, sonuçları doğrulamak için daha zordur. Daha basit bir yöntem, tek aşamalı bir süreç olarak Yuvarlak tabanlı 96-plaka EBS oluşturmaktır. Bu biçim standart in vitro farklılaşma sağlar ve daha deneysel koşullar altında, EB oluşumu ve alt manipülasyon (örneğin modülatör eklenmesi veya çıkarılması) kolaylığı nedeniyle barındırabilir. Ayrıca, 96 plaka biçimi fare ES hücrelerinin etkin bir tarama aracı olarak optimize edilebilir.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Savaş Gazileri İşleri ve NIH hibe 5U01HL100398 ve 1R01HL104040 tarafından desteklenmiştir.
Materials
- Mouse CGR8 cells are mainly used.
- ES medium: GMEM media supplemented with 10% heat-inactivated FBS, 2 mM L-glutamine, 0.05 mM 2-mercaptoethanol, and 200 U/ml murine LIF.
- EB medium: Prepare IMDM media with 20% heat-inactivated FBS, 1.6 mM L-glutamine, 0.08 mM 2-mercaptoethanol, and 1X MEM Non-essential amino acid solution.
Referências
- Fukuda, K., Yuasa, S. Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes. Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).
- Foley, A. C., Mercola, M. Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex. Genes Dev. 19, 387-396 (2005).
- Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).
- Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).
