Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

1. 잘 microtiter 접시를 96 라운드 바텀를 사용하여 배아 바디 (EB) 형성 난생과 보충 마우스 ES 세포 매체와 10cm의 세포 배양 접시에 마우스 ES 세포를 성장. ES 세포는 (일반적으로 50~70%의 합류에서) 사용을위한 준비가되면, ES 미디어를 제거하고 멸균 PBS 5ml로 한 세포를 씻어. 3 ~ 5 분 37 각 플레이트와 부화 플레이트 ° C에 2ml 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가, 3 ML ES 매체와 트립신 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)이 끄다. 3 분 1,000 rpm으로 50ml 팔콘 튜브와 스핀에 세포를 전송합니다. 뜨는 제거하고, resuspend 세포 펠릿 EB 미디어의 원하는 금액과 함께. 휴대폰 번호를 카운트하고 EB 미디어 5 X10 3 셀 / ML로 세포를 희석. 라운드 잘 microtiter 접시 – 96 각 우물에 세포를 포함 EB 미디어 100μl를 추가하는 멀티채널 피펫을 사용합니다. 플레이스 96 – 인큐베이터에 둥근 잘 microtiter 접시. 2. cardiogenesis에 대한 주요 신호 경로 (S)의 중요한 시간 창을 확인 각 96 예 일 0 일 1 일 2 일 3 일 4 우물의 등 반 등 다양한 시간 지점에서 ES 세포를 포함하는 96 – 웰 microtiter 플레이트의 각 우물에 특정 신호 경로 및 차량 제어 모듈 레이터 추가 – 잘 플레이트는 (48 웰스) 치료의 각 시작 시점에 사용됩니다. 다른 정지 시간 지점에서 매 48 우물을위한 EB 미디어를 변경하여 모듈 레이터를 씻으십시오. 예를 들어, 하루 0부터 시작하는 ES 세포의 두 가지 일 치료를 위해 하루에 2 변조기를 씻으십시오. 더 이상 치료 48 시간보다 원하는 정지 시간이 지점까지 이틀 신선한 변조기와 보충 EB 미디어를 변경합니다. 일 6.25 후 현미경 EB 수축을 검사합니다. 각기 다른 치료 시간 코스 EBS를 계약의 비율을 얻기 위해서는 긍정적인 사람으로 EBS를 계약으로 우물을 점수. ES의 cardiogenesis에 대한 중요한 시간이 지점은 차량 제어에 비해 EBS는 신호 변조기에 의해 처리 계약의 높은 비율을 포함하는 시간 프레임입니다. 3. EBS에서 cardiogenesis에 대한 신호의 시간 창을 확인 매달려 방울로 만든 증발을 방지하기 위해 PBS의 3-4 ML로 추가하여 배양 접시를 준비합니다. 단계 1.1 ~ 1.5 2.5×10 4 셀 / ML 최종 세포 농도에서 ES 세포를 준비를 따르십시오. 쉽게 접근할 세균 그릇에 세포 혼합물을 붓고. 멀티채널 피펫을 사용하여 거꾸로 뚜껑에 20 μl 방울 (약 500 세포를 포함) 추가합니다. 개인 방울 연락하는 것을 허용하지 않습니다. 일반적으로 하나의 뚜껑 80 방울까지 들어갈 수 있습니다. PBS를 포함하는 요리를 통해 다시 뚜껑을 플립. 인큐베이터에서 EB 형성을 허용 24 시간 또는 48 시간 동안 부화. EB 미디어과 수영장 새로운 배양 접시에 EBS 2 뚜껑 3 ML 각 뚜껑에서 방울을 걸려에서 형성 EB를 씻으십시오. 10ml의 총 볼륨 EB 미디어를 추가합니다. 0.2 % 일 4 젤라틴 코팅 6 – 잘 접시에 정지에 전송 EBS. 일반적으로 30 EBS는 각 잘으로 전송됩니다. 각 잘에 대한 2 ML 최종 볼륨을 얻을 EB 미디어를 추가합니다. 96 – 웰 플레이트 실험에서 확인된 기간에 변조기 신호 품어. RT – PCR 추가, immunostaining 등, 필요한 경우의 특징 수 일 7 cardiogenesis 후 현미경 EB의 수축을 관찰.