Neurais Colony-Forming Assay Cell: um ensaio para Discriminar Bona Fide células-tronco neurais de células progenitoras neurais

1. Itens que precisam ser preparados antes de prosseguir para Galvanização Cell: Volume apropriado de meio NSC completo é preparado pela mistura NeuroCult NSC Basal Medium e Suplementos NeuroCult NSC Proliferação na proporção 9:1, respectivamente. Uma alíquota de NeuroCult NCFC meio isento de soro sem Citocinas é descongelado. O meio é aquecido em banho-maria a 37 ° C. Soluções estoque de fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento básico de fibroblastos (b-FGF), na concentração de 10 mcg / mL e heparina em 0,2% estão dispostos à frente. Dependendo do tamanho experimento, várias placas de cultura de 35 milímetros de tecido são necessários para a placa de células e um 150-200cm de plástico placa de Petri também é necessária para manter os pratos duplicar 35mm e um terceiro prato 35mm para água. 2. Preparação de células: Dependendo do seu experimento, as células podem ser preparados a partir de uma fonte adulta ou embrionária (tecido dissociado primária ou neurospheres dissociada). Dissecar os tecidos do adulto / embrionárias mouse do sistema nervoso central (SNC) ou dissociar neurospheres adulto / embrionárias derivadas de 1,2 como descrito anteriormente e, em seguida: A suspensão única célula é passado através de um filtro de malha 40 mícrons de tamanho, de modo a remover não-dissociada aglomerados. 10μl da suspensão de células é misturado com 90μl de Trypan azul para realizar uma contagem de células. Nota: Outras diluições célula apropriada também pode ser usado. Se estiver usando embrionárias primárias ou adultas derivadas de células neurais, diluir a suspensão de células a uma concentração de 6,5 x 10 5 células / mL em meio NSC completa. Se estiver usando células de neurospheres dissociada derivado de adulto ou embrionárias células neurais, diluir a suspensão de células a uma concentração de 2,2 x 10 5 células / mL em meio NSC completa. 3. Células chapeamento em meio semi-sólido N-CFCA: O volume apropriado dos seguintes componentes é misturado em ordem, dependendo do número de repetições. Aqui nós misturamos o montante necessário para duas repetições ou duplicar pratos. Para os números de repetições adicionais, consulte a tabela 1. 1,7 mL de NeuroCult NCFC meio isento de soro sem Citocinas 330 mL de Suplementos NeuroCult NSC Proliferação 6,6 mL de EGF (10μg/mL) 32 mL de penicilina / estreptomicina 3,3 mL de b-FGF (10μg/mL) necessária apenas se a cultura de células derivadas de células adultas neural. 3,3 mL de heparina (0,2%) necessitaram de apenas se a cultura de células derivadas de células adultas neural. 25μL da suspensão de células (de 2,2 x 10 5 células / mL de células neurospheres dissociada ou 6,5 x 10 5 células / mL pilhas de tecido do SNC dissociado). Nota: Os números célula final deve ser banhado a cerca de 2500 células por milímetro 35 placa de cultura para neurosphere células derivadas e 7500 células por 35 mm para placa de cultura de células primárias. Em alguns casos, a densidade de células de revestimento final, tem que ser ajustada através da realização de um experimento de titulação celular. Para as análises estatísticas, o número total de colónias detectadas após 21 dias de cultura deve estar dentro do intervalo de pelo menos 50-150 colônias. O meio contendo as células é misturado com cuidado e, em seguida, 1,3 mL de solução de colágeno frio é transferido para a suspensão de células e misturar bem pipetagem suave para evitar a introdução de bolhas. A solução mista é dispensado para o centro de cada placa de cultura de 35 mm (~ 1,5 mL / prato) e os pratos estão inclinados suavemente com movimentos circulares para que a mistura espalhada uniformemente sobre a superfície do prato. . A segunda via placas de cultura de 35 mm são colocados em uma placa de 100 milímetros Petri. A tampa do prato milímetros novo 35 é removido eo prato aberto também é colocado no prato de 100 milímetros mesma Petri. Água estéril é adicionado a este prato mm abrem 35 para manter a umidade ideal durante o período de incubação. Placas de bioensaio quadrado (245 mm) são usadas quando mais replicar 35 milímetros pratos foram criados. Mais uma vez, incluir 2 ou 3 abertas 35 pratos mm contendo água estéril. As placas são transferidas para um conjunto de incubadora a 37 ° C, 5% CO2 e umidade de 95%. O colágeno congela por aumento da temperatura ea formação de gel irá ocorrer dentro de aproximadamente uma hora. As culturas não deve ser perturbado durante este tempo. Células em cultura são incubados por 21 dias (diferenças de tamanho da colônia pode ser claramente distinguido após 21 dias). 4. Preparando Médio Replenishment e Alimentação da Cultura: Como N-CFCA culturas são incubados por um período de tempo prolongado (21 dias), as culturas devem ser alimentados com a NeuroCult apropriado completo médio de reposição preparado fresco da seguinte forma: 4,5 mL de NeuroCult NSC Basal Medium é misturado com 0,5 mL de Suplementos NeuroCult NSC Proliferação Nuclear e, em seguida, os fatores de crescimento é adicionado: 250 L de 10μg/mL EGF (para dar uma concentração final de 0,5 mg / mL EGF) 125 mL de 10μg/mL b-FGF (para dar uma concentração final de 0.25μg/mL b-FGF) necessária apenas se a cultura de células derivadas de células adultas neural. 125 mL de heparina de 0,2%, necessária apenas se a cultura de células derivadas de células adultas neural. 60 mL do Médio completo Replenishment NeuroCult apropriado (por células embrionárias ou adultas) é adicionado para o centro de cada prato Assay NCFC uma vez a cada sete dias durante a incubação cultura NCFC Assay inteiro (21 dias). 5. Colônias de pontuação N-CFC Assay Derivados e Cálculo da Freqüência de bona NSCs Fide e células progenitoras neurais: Cada placa de cultura 35 mm é colocado em um prato de pontuação em grade com o tamanho da grade de 2,0 mm x 2,0 mm e, em seguida, ambos os pratos são colocados no palco microscópio. Usando baixa potência (2.5X – 5X) objetiva de cada prato é digitalizado e as colônias são pontuadas com base em seus tamanhos. Colônias são classificadas em duas categorias principais: Menos de 2 mm de diâmetro ≥ 2 mm de diâmetro 6. Resultados representativos: Como no ensaio neurosphere, as células semeadas em N-CFC ensaio começam a proliferar e fazer pequenas colônias de células dentro de 3-7 dias após o revestimento (Figura 1). Dentro de duas semanas, as colônias de tamanhos diferentes podem ser distinguidos. Embora a maioria das colônias tende a parar de crescer após 14 dias, algumas colônias continuam a aumentar de tamanho. Ao dia 21, as colônias podem ser classificados em uma das quatro categorias: 1) menos de 0,5 mm de diâmetro, 2) 0,5-1 mm de diâmetro, 3) 1-2 mm de diâmetro e 4) ≥ 2mm de diâmetro. Praticamente, colônias menores que 2 mm de diâmetro são referidos como progenitor derivados (Figura 2) e colônias ≥ 2mm de diâmetro são denominados NSC derivados (Figura 3). O número de colónias ≥ 2mm de diâmetro por células totais chapeado, representa a freqüência da real bona fide células-tronco neurais de longo prazo auto-renovação e potencial multi-capacidades. O total de neurosphere formando freqüência em uma determinada população celular após 7-8 dias em um experimento paralelo NSA foi estimado para ser semelhante ao do total da colónia formando freqüência da população de células mesmo após 21 dias em um experimento de N-CFCA. O N-CFCA no entanto, oferece uma condição mais permissiva, de modo cada célula pode mostrar todo seu potencial proliferativo. Componente 2 repetições 3 repetições 4 repetições NeuroCult NCFC meio isento de soro sem Citocinas 1700 2550 3400 NeuroCult NSC Suplementos Proliferação 330 495 660 EGF (10 mcg / mL) 6,6 9,9 13,2 bFGF (10 mcg / mL), apenas para células adultas 3,3 4,95 6,6 Solução de heparina (0,2%), apenas para células adultas 3,3 4,95 6,6 Penicilina estreptomicina / (1:100) 32 48 64 Células em: 2,2 x 10 5 cultura de células / ml ou 6,5 x 10 5 células primárias / mL 25 37,5 50 Solução de colágeno 1300 1950 2600 Tabela 1. Componentes da cultura ensaio completo N-CFC. Figura 1. Colônias Representante na N-CFCA cultura de NSCs uma passagem E14 rato sete dias após o plaqueamento. As colônias podem exibir morfologia diferente e tamanho. Ampliação original; 4x Figura 2. Colônias progenitor Representante derivados de diferentes tamanhos em N-CFCA cultura de uma passagem do mouse E14 NSCs 21 dias após o plaqueamento. Como mostrado, as colônias têm morfologia diferente, mas todos são mm menos 2 em tamanho. Ampliação original; 4x Figura 3. Representante bona fide de células-tronco derivadas colônia em N-CFCA cultura de uma passagem do mouse E14 NSCs 21 dias após o plaqueamento. Colônias de células-tronco derivadas podem exibir morfologia diferentes (vero vídeo), mas todos são ≥ 2mm de diâmetro. Ampliação original; 4x