עצבית, המושבה יצירת Assay נייד: Assay להפלות בונה תאים בתום גזע עצביים מן ובתאים עצבית

1. הפריטים צריכים להיות מוכנים לפני שתמשיך ציפוי נייד: נפח מתאים של המדיום המל"ל להשלים הוא מוכן על ידי ערבוב NeuroCult בינוני NSC הבסיס, NeuroCult NSC תוספי הפצת ביחס 9:01 בהתאמה. Aliquot של בינונית NeuroCult סרום ללא NCFC ללא ציטוקינים הינו מופשר. המדיום הוא התחמם בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. פתרונות במלאי של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), הצמיחה הבסיסית גורם fibroblastic (ב-FGF) בריכוז של 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו – הפרין ב -0.2% מוכנים מראש. בהתאם לגודל הניסוי, מספר 35mm תרבות מנות רקמה יש צורך בתאים צלחת אחת 150-200cm פלסטיק צלחת פטרי נחוץ גם כדי להחזיק את הכלים 35mm כפולות צלחת 35mm שלישי מים. 2. תא הכנה: בהתאם הניסוי שלך, תאים יכולים להיות מוכנים ממקור מבוגר או עובריים (רקמה ניתק ראשוני או neurospheres ניתק). לנתח רקמות מן הבוגרים / עכבר עובריים במערכת העצבים המרכזית (CNS) או לנתק neurospheres מבוגר / עובריים שמקורם כפי שתואר לפני 1,2 ואז: השעיית תא בודד עובר דרך פילטר של 40 מיקרומטר בגודל רשת כדי להסיר אי – ניתק גושים. 10μl ההשעיה התא הוא מעורבב עם 90μl של Trypan כחול לבצע ספירת תאים. הערה: דילולים אחרים בתא המתאים יכול לשמש גם. אם אתה משתמש עובריים ראשוני או מבוגר תאים עצביים שמקורם, לדלל את ההשעיה התא בריכוז של 6.5 x 10 5 תאים / מ"ל במדיום המל"ל להשלים. אם באמצעות תאים neurospheres ניתק נגזר תאים עצביים למבוגרים או עובריים, לדלל את ההשעיה התא בריכוז של 2.2 x 10 5 תאים / מ"ל במדיום המל"ל להשלים. 3. ציפוי תאים בינוני N-CFCA חצי מוצק: הכרך המתאים את הרכיבים הבאים מעורבת כדי, תלוי במספר משכפל. כאן אנו לערבב את הסכום הדרוש עבור שני משכפל או לשכפל הכלים. עבור מספרים נוספים של משכפל, עיין בטבלה 1. 1.7 מ"ל של מדיום NeuroCult סרום ללא NCFC ללא ציטוקינים 330 μL של NeuroCult תוספי NSC הפצת נשק גרעיני 6.6 μL של EGF (10μg/mL) 32 μL של פניצילין / סטרפטומיצין 3.3 μL של b-FGF (10μg/mL) נדרש רק אם culturing תאים שמקורם תאים עצביים למבוגרים. 3.3 μL של הפרין (0.2%) נדרש רק אם culturing תאים שמקורם תאים עצביים למבוגרים. 25μL ההשעיה תאים (של 2.2 x 10 5 תאים / מ"ל תאים מן neurospheres ניתק או 6.5 x 10 5 תאים / מ"ל תאים ראשוניים מרקמת ניתק CNS). הערה: המספרים התא מצופה הסופי צריך להיות בערך 2500 תאים לכל צלחת 35 מ"מ תרבות עבור תאים שמקורם neurosphere ו 7500 תאים לכל צלחת 35 מ"מ עבור התרבות תאים ראשוניים. במקרים מסוימים, את הצפיפות הסופית ציפוי התא חייב להיות מותאם על ידי ביצוע ניסוי טיטרציה התא. עבור ניתוחים סטטיסטיים, המספר הכולל של מושבות שזוהו לאחר 21 ימים של תרבות צריכה להיות בטווח של לפחות 50-150 מושבות. המדיום המכיל את התאים מעורבת בעדינות ולאחר מכן 1.3 מ"ל של תמיסת קולגן קר מועבר ההשעיה התא ומעורבים היטב על ידי pipetting עדין כדי למנוע החדרת כל הבועות. הפתרון הוא לוותר מעורבת למרכז של כל מנה תרבות 35mm (~ 1.5 mL / תבשיל) וכן את הכלים הם היטה בעדינות בתנועות מעגליות לתת לתערובת להתפשט באופן שווה על פני השטח של המנה. . לשכפל 35 מ"מ תרבות מנות ממוקמות לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ. המכסה של מאכל חדש 35 מ"מ הוא להסיר את המנה לפתוח ממוקמת גם את צלחת פטרי 100 מ"מ אותו. מים סטריליים מתווסף צלחת זה 35 מ"מ פתוח כדי לשמור על לחות אופטימלית במהלך תקופת הדגירה. צלחות המבדק סקוור (245 מ"מ) משמשים כאשר לשכפל עוד 35 מנות מ"מ הוקמו. שוב, כולל 2 או 3 מנות פתוח 35 מ"מ המכיל מים סטריליים. הלוחות מועברים להגדיר באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו 95% לחות. נקרש קולגן על ידי הגדלת הטמפרטורה היווצרות קריש תתרחש בתוך כשעה. תרבויות לא צריך להיות מופרע בתקופה זו. תאים בתרבית מודגרת במשך 21 ימים (הבדלים בגודל המושבה ניתן להבחין בבירור לאחר 21 ימים). 4. הכנת בינוני רענון והאכלת תרבות: כמו N-CFCA תרבויות מודגרת לתקופה ממושכת של זמן (21 ימים), תרבויות צריך להיות מוזן עם NeuroCult המלא הולם בינוני חידוש מוכן טרי כדלקמן: 4.5 מ"ל של מדיום NSC NeuroCult בסל הוא מעורבב עם 0.5 מ 'L של NeuroCult תוספי NSC הפצת נשק ולאחר מכן את גורמי גדילה הוא הוסיף: 250 μL של 10μg/mL EGF (לתת הריכוז הסופי של 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​EGF) 125 μL של 10μg/mL ב-FGF (לתת הריכוז הסופי של 0.25μg/mL ב-FGF) נדרש רק אם culturing תאים שמקורם תאים עצביים למבוגרים. 125 μL של הפרין 0.2%, נדרש רק אם culturing תאים שמקורם תאים עצביים למבוגרים. 60 μL של NeuroCult בינונית המתאימה להשלים רענון (עבור תאים עובריים או מבוגר) יתווסף למרכז של כל מנה Assay NCFC פעם 7 ימים במהלך הדגירה Assay כולו NCFC תרבות (21 ימים). 5. ניקוד N-CFC המושבות Assay נגזר חישוב תדירות NSCs בתום לב ועל ובתאים עצבית: 35 כל תרבות צלחת מ"מ מונח על צלחת הבקיע gridded עם גודל רשת של 2.0 מ"מ x 2.0 מ"מ ואז הן המנות מונחות על הבמה מיקרוסקופ. באמצעות צריכת חשמל נמוכה (2.5x – 5X) המטרה העדשה, כל מנה נסרק המושבות הם הבקיע מבוסס על הגדלים שלהם. מושבות מסווגים לשתי קטגוריות עיקריות: פחות מ 2 מ"מ קוטר ≥ 2 מ"מ קוטר 6. נציג תוצאות: כמו assay neurosphere, תאים מצופה ב assay N-CFC להתחיל להתרבות ולגרום מושבות קטנות של תאים בתוך 3 – 7 ימים לאחר ציפוי (איור 1). בעוד שבועיים, מושבות בגדלים שונים ניתן להבחין. בעוד מרבית מושבות נוטים להפסיק לגדול לאחר 14 ימים, כמה מושבות להמשיך להגדיל את שטחו. ביום 21, מושבות ניתן לסווג לאחת מארבע קטגוריות: 1) פחות מ -0.5 מ"מ קוטר, 2) 0.5-1 מ"מ קוטר, 3) 1-2 מ"מ קוטר 4) ≥ 2 מ"מ בקוטר. למעשה, מושבות קטן יותר מאשר קוטר 2 מ"מ מכונים אבי נגזרת (איור 2) ומושבות ≥ 2 מ"מ בקוטר מכונים המל"ל נגזרת (איור 3). מספר מושבות ≥ 2 מ"מ בקוטר לכל התאים הכולל מצופה, מייצג את התדירות של התאים בפועל בתום לב גזע עצביים עם התחדשות עצמית לטווח ארוך ורב פוטנציאל היכולות. Neurosphere הכולל הקמת תדר באוכלוסייה תא מסוים אחרי יום 7-8 בניסוי NSA במקביל הוערך להיות דומה המושבה הכולל הקמת תדר של האוכלוסייה באותו התא לאחר 21 ימים בניסוי N-CFCA. N-CFCA לעומת זאת, מספק תנאי מתירני יותר כמו כל תא יכול להראות פוטנציאל שגשוג המלא. רכיב 2 משכפל 3 משכפל 4 משכפל NeuroCult NCFC סרום ללא בינוני ללא ציטוקינים 1700 2550 3400 NeuroCult NSC הפצת תוספי 330 495 660 EGF (10 מיקרוגרם / מ"ל) 6.6 9.9 13.2 bFGF (10 מיקרוגרם / מ"ל), רק תאים בוגרים 3.3 4.95 6.6 הפתרון הפרין (0.2%), רק תאים בוגרים 3.3 4.95 6.6 פניצילין / סטרפטומיצין (1:100) 32 48 64 תאים ב: 2.2 x 10 5 תאים בתרבית / mL או 6.5 x 10 5 תאים ראשוניים / mL 25 37.5 50 קולגן פתרון 1300 1950 2600 טבלה 1. רכיבים של התרבות N-CFC להשלים assay. באיור 1. מושבות נציג בתרבות N-CFCA אחד E14 NSCs מעבר העכבר 7 ימים לאחר ציפוי. מושבות עשוי להציג מורפולוגיה גודל שונים. הגדלה מקורי; 4x איור 2. מושבות אבי נציג נגזר בגדלים שונים בתרבות N-CFCA בקטע אחד של E14 NSCs עכבר 21 ימים לאחר ציפוי. כפי שניתן לראות, מושבות יש מורפולוגיה שונה אבל כל 2 מ"מ פחות בגודל. הגדלה מקורי; 4x איור 3. Bona נציג תא גזע בתום נגזר המושבה בתרבות N-CFCA את הקטע של E14 NSCs עכבר 21 ימים לאחר ציפוי. תא גזע שמקורם מושבות עשוי להציג מורפולוגיה שונה (ראהאת הוידאו) אך כולם ≥ 2 מ"מ בקוטר. הגדלה מקורי; 4x