Hücre Testi Şekillendirme Sinir-Koloni: Sinir Progenitör Hücreler Bona Fide Sinir Kök Hücreler Ayırım Bir Testi

1. Hazırlayan: Hücre Kaplama Başlamadan Önce olun gerekiyor Öğeler: Tam MGK orta Uygun hacmi, 09:01 oranında NeuroCult MGK Bazal Orta ve NeuroCult MGK Silahların Yayılmasını Önleme Takviyeler sırasıyla karıştırılarak hazırlanır. NeuroCult NCFC Serum-Alerjik Orta Sitokinler olmadan bir kısım çözülmüş. Orta, 37 ° C su banyosunda ısıtılır. Epidermal büyüme faktörü (EGF), 10 mg / ml% 0.2 ve heparin konsantrasyonu temel fibroblastik büyüme faktörü (b-FGF) Stok çözümleri önceden hazırlanır. Deney boyutuna bağlı olarak, birkaç 35mm doku kültürü yemekleri plaka hücreleri ve bir 150-200cm plastik Petri kabı da yinelenen 35mm yemekleri tutmak için gerekli olan ve üçüncü bir su 35mm çanak ihtiyaç vardır. 2. Cep Hazırlanışı: Denemenizi bağlı olarak, hücrelerin embriyonik veya erişkin bir kaynak (birincil ayrışmış bir doku ya da ayrışmış neurospheres) hazırlanabilir. Yetişkin / embriyonik fare merkezi sinir sistemi (MSS) dokular disseke veya daha sonra 1,2 ve daha önce açıklandığı gibi embriyonik türetilen / yetişkin neurospheres ayrıştırmaları: Tek hücre süspansiyonu 40 mikron boyutlu gözenekli filtre geçirilir şekilde ayrışmış olmayan kümeleri kaldırmak. 10μl hücre süspansiyonu, hücre sayımı gerçekleştirmek için Tripan mavi 90μl ile karıştırılır Not: Diğer uygun hücre dilüsyonları de kullanılabilir . Eğer birincil embriyonik veya yetişkin elde edilen sinir hücreleri kullanarak, tam MGK orta 6,5 x 10 5 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon hücre süspansiyonu sulandırmak. Hücreleri, yetişkin ya da embriyonik sinir hücrelerinden elde edilen ayrışmış neurospheres kullanıyorsanız, tam MGK orta 2.2 x 10 5 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon hücre süspansiyonu sulandırmak . 3. Yarı-katı N-CFCA Orta Kaplama Hücreler: Aşağıdaki bileşenlerin uygun hacmi tekerrür sayısına bağlı olarak, sipariş karıştırılır. Burada çoğaltır iki için gerekli miktarı karıştırın veya yinelenen yemekleri. Çoğaltır ek numaraları için, tablo 1'e bakınız. Sitokinler olmadan NeuroCult NCFC Serum-Alerjik Orta 1.7 mL 330 mcL NeuroCult MGK Silahların Yayılmasını Önleme Takviyeler 6.6 mcL EGF (10μg/mL) Penisilin / Streptomisin 32 mcL B-FGF (10μg/mL) 3.3 mcL hücreleri kültür yetişkin sinir hücrelerinden elde edilen sadece gerekli. Heparin (% 0.2) 3.3 mcL hücreleri kültür yetişkin sinir hücrelerinden elde edilen sadece gereklidir. Hücre süspansiyonu 25μL (2.2 ayrışmış neurospheres veya 6.5 x 10 5 hücre / mL birincil hücreler ayrışmış MSS dokusu x 10 5 hücre / mL hücreleri) Not: son hücre sayıları kaplama, 35 mm kültürü çanak başına yaklaşık 2500 hücre olmalıdır neurosphere edilen hücreler ve birincil hücreler için 35 mm kültür çanak başına 7500 hücreleri. Bazı durumlarda, nihai hücre kaplama yoğunluğu bir hücre titrasyon deneyi yaparak ayarlanması gerekir. 150 koloniler istatistiksel analizler için, kültür 21 gün sonra tespit edilen kolonilerin toplam sayısı en az 50 aralığında olmalıdır. Içeren hücreler orta 1.3 mL soğuk Kollajen çözüm hücre süspansiyonu aktarılır ve herhangi bir kabarcıkları tanıtan önlemek için yumuşak pipetleme iyice karıştırılır ve sonra hafifçe karıştırılır. Karma çözüm her 35mm kültür çanak (~ 1.5 mL / çanak) merkezi dağıtılır ve yemekleri karışımı yemeğin yüzeyi üzerinde eşit biçimde yayılmasına izin dairesel hareketlerle hafifçe kullanarak uçlu. . Yinelenen 35 mm kültür kaplarına 100 mm Petri plaka yerleştirilir. Yeni 35 mm çanak kapağı çıkarılır ve açık bir tabak da aynı 100 mm Petri kabı yerleştirilir. Steril su kuluçka dönemi sırasında optimum nemi korumak için, bu açık 35 mm çanak eklenir. Kare biyoassay levhalar (245 mm) 35 mm yemekleri daha çoğaltmak kurulmuş olduğunda kullanılır. Yine, 2 ya da steril su içeren 3 adet açık, 35 mm yemekleri içerir. Plakalar 37 kuvöz ayarlamak için transfer ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem. Kollajen congeals artan sıcaklık ve jel oluşumu tarafından yaklaşık bir saat içinde gerçekleşir. Kültürleri, bu süre içinde rahatsız olmamalıdır. Kültüre hücreleri 21 gün (21 gün sonra koloni boyutu farklar açıkça ayırt edilebilir) boyunca inkübe edilir. 4. Yenileme Orta hazırlanması ve Kültür Besleme: N-CFCA kültürleri bir süre (21 gün) uzun süre inkübe olarak, kültürler uygun tam NeuroCult ile beslenmelidir ikmal orta aşağıdaki gibi taze olarak hazırlanır: NeuroCult MGK Bazal Orta 4.5 mL 0.5 m karışıkL NeuroCult MGK Silahların Yayılmasını Önleme Destekleri ve büyüme faktörleri sonra eklenir: 250 mcL 10μg/mL EGF (0.5 mikrogram / ml EGF nihai konsantrasyonu vermek için) 10μg/mL b-FGF (0.25μg/mL b-FGF final konsantrasyon vermek için) 125 mcL hücreleri kültür yetişkin sinir hücrelerinden elde edilen sadece gerekli. % 0.2 Heparin 125 mcL, kültür hücreleri, yetişkin sinir hücrelerinden elde edilen sadece gerekli . Uygun NeuroCult Yenileme Orta (embriyonik veya erişkin hücreler için) 60 mcL tüm NCFC Testi kültürü inkübasyon (21 gün) boyunca her 7 günde bir her NCFC Testi çanak merkezine eklenir. 5. N-CFC Testi Türetilmiş Kolonileri Puanlama ve Bona Fide NSC'lerde ve Sinir Progenitör Hücreler Frekans hesaplanması: Her 35 mm kültür çanak ızgara boyutu ile 2.0 mm x 2.0 mm ızgara puanlama tabağına yerleştirilir ve sonra her iki yemekleri mikroskop aşamasında yerleştirilir. Objektif lens, her bir çanak taranır ve koloniler kendi boyutlarına göre puanlanır (5X 2.5X) düşük güç kullanma. Kolonileri iki ana kategoriye ayrılır: 2 mm çapında daha az ≥ 2 mm çaplı 6. Temsilcisi Sonuçlar: Kaplama 7 gün sonra (Şekil 1) – neurosphere tayininde, N-CFC tayininde kaplama hücreleri prolifere hücre küçük koloniler 3 gün içinde yapmak için başlayın. Iki hafta içinde, farklı boyutlarda koloni ayırt edilebilir. 14 gün sonra büyüyen kolonilerin çoğunluğu durdurmak için eğiliminde iken, bazı koloniler boyutu artmaya devam. 1 mm çapında, 3) 1 – 2 mm çapında ve 4) ≥ 2mm çapında en az 0,5 mm çapında, 2) 0.5) 1: 21 gün, koloniler dört kategoriden birine sınıflandırılır olabilir. Uygulamada, 2 mm çapından daha küçük koloniler progenitör türetilmiştir olarak adlandırılır (Şekil 2) ve MGK (Şekil 3) türetilen koloniler çapı ≥ 2mm adlandırılır. Kaplama toplam hücre ortalama çapı ≥ 2mm kolonilerin sayısı, uzun vadeli kendini yenileyen ve çok potansiyel yetenekleri ile gerçek bona fide sinir kök hücrelerinin sıklığı temsil eder. Paralel bir NSA deneyde 7-8 gün sonra belirli bir hücre popülasyonu frekans oluşturan toplam neurosphere N-CFCA deneyde 21 gün sonra aynı hücrede nüfus sıklığı toplam koloni oluşturan benzer olması tahmin ediliyor. N-CFCA Ancak, her bir hücrenin tam proliferatif potansiyeli gösterebilir kadar, daha müsamahakâr bir durum sağlar. Bileşen 2 çoğaltır 3 çoğaltır 4 çoğaltır Sitokinler olmadan NeuroCult NCFC Serum-Alerjik Orta 1700 2550 3400 NeuroCult MGK Silahların Yayılmasını Önleme Takviyeler 330 495 660 EGF (10 mg / ml) 6,6 9,9 13,2 Sadece yetişkin hücreler için bFGF (10 mg / ml), 3,3 4,95 6,6 Heparin sadece yetişkin hücreler için Çözüm (% 0.2), 3,3 4,95 6,6 Penisilin / Streptomisin (1:100) 32 48 64 Az Hücreler: 2.2 x 10 5 kültürlü hücre / ml VEYA 6.5 x 10 5 birincil hücre / ml 25 37,5 50 Kollajen Çözüm 1300 1950 2600 Tablo 1 eksiksiz bir N-CFC tahlil kültür Bileşenleri. Şekil 1. geçit bir E14 fare NSC'lerde N-CFCA kültür Temsilcisi koloniler 7 gün sonra kaplama. Koloniler farklı morfoloji ve boyutunu görüntülemek olabilir. Orijinal büyütme; 4x Şekil 2 N-CFCA pasaj kültürünün farklı boyutları kaplama 21 gün sonra bir E14 fare NSC'lerde Temsilcisi progenitör elde edilen koloniler. Gösterildiği gibi, farklı koloniler morfoloji var ama boyutu az 2 mm. Orijinal büyütme; 4x Şekil 3. Temsilcisi bona fide kök hücre kaplama 21 gün sonra geçiş bir E14 fare NSC'lerde N-CFCA kültüründe koloni türetilmiştir. Kök hücre elde edilen koloniler farklı morfoloji gösterebilir (bkz.video) ama çapı ≥ 2mm. Orijinal büyütme; 4x