Neural-Formant Colonie dosage cellulaire: Un test pour distinguer Bona Fide Cellules souches neuronales à partir de cellules progénitrices neurales

1. Éléments qui doivent être préparés Avant de procéder à Placage Cellulaire: Volume approprié de milieu complet NSC est préparée en mélangeant NeuroCult NSC moyen basale et NeuroCult NSC Suppléments prolifération à un ratio 9:1, respectivement. Une aliquote de NeuroCult NCFC milieu sans sérum, sans cytokines est décongelé. Le milieu est chauffé dans un bain d'eau à 37 ° C. Les solutions mères du facteur de croissance épidermique (EGF), facteur de croissance basique fibroblastique (b-FGF) à la concentration de 10 pg / mL et héparine à 0,2% sont préparés à l'avance. Selon la taille expérimentation, plusieurs boîtes de culture tissulaire de 35 mm sont nécessaires à l'assiette des cellules et un plat en plastique 150-200cm de Petri est également nécessaire de tenir les plats double de 35mm et un troisième plat 35mm d'eau. 2. Préparation des cellules: Selon votre expérience, les cellules peuvent être préparés à partir d'une source adultes ou embryonnaires (primaire ou de tissu dissocié neurosphères dissociées). Disséquer les tissus de l'adulte / embryons de souris du système nerveux central (SNC) ou dissocier neurosphères adulte / embryonnaires dérivées comme décrit précédemment 1,2 et ensuite: La suspension cellulaire unique est passé à travers un filtre à mailles de 40 um de taille de manière à supprimer non dissociée des touffes. 10 ul de la suspension cellulaire est mélangé avec 90μl de bleu trypan pour effectuer un comptage des cellules. Remarque: D'autres dilutions cellule appropriée peut également être utilisé. Si vous utilisez embryonnaire ou adulte primaires dérivées des cellules neurales, diluer la suspension cellulaire à une concentration de 6,5 x 10 5 cellules / ml dans un milieu complet NSC. Si utilisant des cellules de neurosphères dissociées provenant adultes ou embryonnaires des cellules neurales, diluer la suspension cellulaire à une concentration de 2,2 x 10 5 cellules / ml dans un milieu complet NSC. 3. Cellules Placage des semi-solide N-ACCP moyen: Le volume approprié des composants suivants sont mélangés dans l'ordre, selon le nombre de répétitions. Ici, nous mélanger la quantité nécessaire pour deux répétitions ou de dupliquer des plats. Pour les nombres de répétitions supplémentaires, s'il vous plaît se référer au tableau 1. 1,7 ml de NeuroCult NCFC milieu sans sérum, sans cytokines 330 uL de suppléments NeuroCult prolifération NSC 6,6 uL d'EGF (10μg/mL) 32 uL de pénicilline / streptomycine 3,3 uL de b-FGF (10μg/mL) requis uniquement si la culture de cellules dérivées de cellules neurales adultes. 3,3 uL de l'héparine (0,2%) requis uniquement si la culture de cellules dérivées de cellules neurales adultes. 25 pi de suspension cellulaire (de 2,2 x 10 5 cellules / ml à partir des cellules neurosphères dissociées ou 6,5 x 10 5 cellules / ml de cellules primaires à partir de tissus du système nerveux central dissocié). Note: Les numéros de cellulaire finale plaquée devrait être d'environ 2500 cellules par boîte de 35 mm de la culture pour les cellules dérivées Neurosphère et 7500 cellules par boîte de 35 mm pour la culture de cellules primaires. Dans certains cas, la densité cellulaire finale plaquage doit être ajustée en effectuant une expérience de titrage cellule. Pour les analyses statistiques, le nombre total de colonies détectées après 21 jours de culture doit être dans la plage d'au moins 50 à 150 colonies. Le milieu contenant les cellules est mélangé doucement puis 1,3 ml de solution de collagène froid est transféré à la suspension cellulaire et bien mélangés par pipetage doux pour éviter d'introduire des bulles. La solution mixte est dispensé au centre de chaque boîte de culture 35mm (~ 1,5 ml / boîte) et les plats sont inclinés en douceur en utilisant un mouvement circulaire pour laisser le mélange réparti uniformément sur la surface du plat. . Les 35 boîtes de culture reproduire mm sont placés dans une plaque de Pétri de 100 mm. Le couvercle de la nouvelle boîte de 35 mm est enlevé et la capsule ouverte est également placé dans le même plat de Pétri de 100 mm. L'eau stérile est ajoutée à cette boîte de 35 mm ouverte pour maintenir l'humidité optimale pendant la période d'incubation. Bioessai plaques carrées (245 mm) sont utilisés lorsque plus de reproduire des boîtes de 35 mm ont été mis en place. Encore une fois, comprennent 2 ou 3 boîtes de 35 mm ouvert contenant de l'eau stérile. Les plaques sont transférées à un incubateur réglé à 37 ° C, 5% de CO2 et 95% d'humidité. Le collagène fige en augmentant la température et la formation de gel se fera dans environ une heure. Les cultures ne devraient pas être dérangé pendant ce temps. Les cellules cultivées sont incubées pendant 21 jours (les différences de taille des colonies peuvent être clairement distingués, après 21 jours). 4. Préparation moyen reconstitution et de Nourrir la culture: Comme la N-ACCP cultures sont incubées pendant une longue période de temps (21 jours), les cultures doivent être nourris avec les NeuroCult appropriée complète moyennes de réapprovisionnement fraîchement préparés comme suit: 4,5 ml de NeuroCult NSC milieu de base est mélangée avec 0,5 mL de suppléments NeuroCult prolifération NSC et ensuite les facteurs de croissance est ajouté: 250 ul d'10μg/mL EGF (pour donner une concentration finale de 0,5 pg / ml EGF) 125 ul d'10μg/mL b-FGF (pour donner une concentration finale de 0.25μg/mL b-FGF) requis uniquement si la culture de cellules dérivées de cellules neurales adultes. 125 ul d'héparine de 0,2%, requis uniquement si la culture de cellules dérivées de cellules neurales adultes. 60 uL du milieu approprié NeuroCult complète reconstitution (pour les cellules embryonnaires ou adultes) est ajouté dans le centre de chaque plat Assay NCFC fois tous les 7 jours pendant l'incubation toute Assay NCFC la culture (21 jours). 5. Scoring colonies Assay N-CFC dérivés et calcul de la fréquence de bonne NSCs Fide et cellules progénitrices neurales: Chaque plat de 35 mm de la culture est placée sur un plat notation quadrillées avec la taille de grille de 2,0 mm x 2,0 mm, puis les deux plats sont placés sur la platine du microscope. L'utilisation de faible puissance (2.5X – 5X) lentille d'objectif, chaque plat est numérisé et les colonies sont marqués en fonction de leurs tailles. Les colonies sont classés en deux grandes catégories: Moins de 2 mm de diamètre Diamètre ≥ 2 mm 6. Les résultats représentatifs: Comme dans l'essai Neurosphère, cellules étalées dans le N-CFC test commencent à proliférer et de faire de petites colonies de cellules dans les 3 – 7 jours après le placage (figure 1). Dans deux semaines, des colonies de tailles différentes peuvent être distinguées. Bien que la majorité des colonies ont tendance à cesser de croître après 14 jours, certaines colonies continuent à augmenter en taille. En 21 jours, les colonies peuvent être classés dans l'une des quatre catégories: 1) moins de 0,5 mm de diamètre, 2) 0,5 – 1 mm de diamètre, 3) 1 – 2 mm de diamètre et 4) ≥ 2mm de diamètre. Pratiquement, les colonies plus petites que 2 mm de diamètre sont considérés comme des dérivés progénitrices (figure 2) et les colonies ≥ 2mm de diamètre sont considérés comme des dérivés NSC (Figure 3). Le nombre de colonies ≥ 2mm de diamètre par nombre total de cellules plaquées, représente la fréquence de la réelle bonne foi des cellules souches neurales à long terme d'auto-renouvellement et multi-potentiels capacités. Le total faisant Neurosphère fréquence dans une population de cellules particulières après 7-8 jours dans une expérience parallèle NSA a été estimée à être semblable à la colonie formant au total la fréquence de la même population cellulaire après 21 jours dans une expérience N-ACCP. La N-ACCP prévoit toutefois une condition plus permissive afin que chaque cellule peut montrer tout son potentiel prolifératif. Composante 2 répétitions 3 répétitions 4 répétitions NeuroCult NCFC milieu sans sérum, sans cytokines 1700 2550 3400 NeuroCult NSC Suppléments prolifération 330 495 660 EGF (10 pg / ml) 6.6 9.9 13,2 bFGF (10 pg / ml), uniquement pour les cellules adultes 3.3 4,95 6.6 Solution d'héparine (0,2%), uniquement pour les cellules adultes 3.3 4,95 6.6 Pénicilline / streptomycine (1:100) 32 48 64 Les cellules à l'adresse: 2,2 x 10 5 cellules cultivées / ml ou 6,5 x 10 5 cellules primaires / mL 25 37,5 50 Solution de collagène 1300 1950 2600 Tableau 1. Composantes de la culture d'essai complète N-CFC. Figure 1. Colonies représentant de la N-ACCP culture de la souris à un seul passage NSCs E14 7 jours après placage. Les colonies peuvent afficher la morphologie et de taille différentes. Le grossissement est de; 4x Figure 2. Colonies progénitrices dérivées Représentant de différentes tailles dans la N-ACCP culture de passage on E14 NSCs souris 21 jours après placage. Comme indiqué, les colonies ont une morphologie différente, mais toutes sont à moins de 2 mm de la taille. Le grossissement est de; 4x Représentant la figure 3. Bona fide de cellules souches dérivées colonie en N-ACCP culture de passage on E14 NSCs souris 21 jours après placage. Colonies de cellules souches dérivées pourrait afficher morphologie différente (voirla vidéo) mais tous sont ≥ 2mm de diamètre. Le grossissement est de; 4x