iCLIP - транскриптома всей карты белка-РНК взаимодействия с отдельными нуклеотидных Резолюцию

1. УФ сшивания тканей культуре клеток Выньте материал и добавить 6 мл ледяной PBS для клеток, выращенных в 10 см плита (достаточно для трех экспериментов). Удалите крышку и поставьте на лед. Радиация сразу с 150 мДж / см 2 при 254 нм. Урожай клетки путем соскабливания с сотовым Колмар. Передача 2 мл клеточной суспензии для каждой из трех пробирок. Спиновые на максимальной скорости в течение 10 сек при 4 ° С для осаждения клеток, затем удалите супернатант. Snap-заморозить ячейки гранул на сухом льду и хранить при температуре -80 ° С до использования. 2. Бусы подготовки Добавить 100 мкл белка Dynabeads (Dynal, 100,02) в эксперименте по свежим микропробирок (Используйте белка G Dynabeads для мыши или козьего антитела). Вымойте бисером 2x с лизирующего буфера (50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 100 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% натрия дезоксихолата; 1 / 100 ингибитор протеазы коктейль III, Calbiochem). Ресуспендируют бисером в 100 мкл буфера для лизиса с 2-10 мкг антител. Поворот трубы при комнатной температуре в течение 30-60 мин. Вымойте 3x с 900 мкл буфера для лизиса и оставить в последние мыть пока готов перейти к шагу 4.1. 3. Лизису клеток и частичного расщепления РНК Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл буфера для лизиса и передачи до 1,5 мл пробирок. Подготовка 1 / 500 разбавление РНКазы I (Амбион, AM2295). Добавьте 10 мкл РНКазы я разведения, а также 2 мкл Turbo ДНКазы для Клеточный лизат (1 / 500 РНКазы я разведения [с низким РНКазы] используются для подготовки библиотеки; 1 / 50 разведений [высокая РНКазы] являются необходимыми для осуществления контроля на наличие антител специфичность) . Инкубируйте образцы ровно 3 мин при 37 ° С, качая на 1100 оборотах в минуту. Сразу же передачи в лед. Спиновые при 4 ° С и 22 000 г в течение 20 минут, чтобы очистить лизат. Осторожно собрать супернатант (оставьте примерно 50 мкл лизата с гранул). 4. Иммунопреципитация Удалите промывочный буфер из бисера (с шагом 2,5), затем добавить Клеточный лизат (с шагом 3,4). Поворот образцов в течение 2 ч при 4 ° C. Удалите супернатант и мыть бисером 2x с 900 мкл высокого соль буфера (50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 1 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% натрия дезоксихолата). Вымойте 2x с 900 мкл промывочного буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 10 мМ MgCl 2, 0,2% Твин-20). 5. Дефосфорилирования РНК 3'ends Удалите супернатант и ресуспендируйте бисером в 20 мкл смеси PNK (15 мкл воды, 4 мкл 5x рН 6,5 PNK буфера [350mMTris-HCl, рН 6,5; 50mMMgCl 2 25mMdithiothreitol]; 0,5 мкл фермента ПНК; 0,5 мкл RNasin [Promega]). Инкубируйте в течение 20 минут при температуре 37 ° C. Добавить 500 мкл промывочного буфера и мыть 1x с высокой соли буфера. Вымойте 2x промывочным буфером. 6. Компоновщик лигирования РНК 3 'концах Осторожно удалите супернатант и ресуспендируйте бисером в 20 мкл смеси лигирования (9 мкл воды, 4 мкл 4х буфер лигирования [200 mMTris-HCl, 40 ММ GCL 2, 40 мМ дитиотреитол]; 1 мкл РНК-лигазы [NEB]; 0,5 мкл RNasin [Promega]; 1,5 мкл предварительно adenylated линкера L3 [20 мкМ]; 4 мкл PEG400 [81170, Sigma]). Выдержите в течение ночи при 16 ° С. Добавить 500 мкл промывочного буфера и затем промыть 2 раза с 1 мл высокого соль буфера. Вымойте 2x с 1 мл промывочного буфера и оставить в 1 мл второй стирки. 7. Конец РНК 5 'маркировки Удалить супернатант и ресуспендируйте бусины 8 мкл горячей смеси PNK (0,4 мкл PNK [NEB]; 0,8 мкл 32 Р-γ-АТФ; 0,8 мкл 10х буфера PNK [NEB]; 6 мкл воды). Инкубировать в течение 5 мин при 37 ° C. Удалить горячей смеси ПНК и ресуспендируйте бисером в 20 мкл Nupage 1x загрузки буфера (Invitrogen). Инкубировать на thermomixer при 70 ° С в течение 10 мин. Сразу же место на магнит для осаждения пустой бисером и нагрузки супернатант на геле (см. шаг 8). 8. SDS-PAGE и мембранных передачи Нагрузка образцов на 4-12% NuPAGE Bis-Tris гель (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Используйте 0,5 л 1x MOPS работает буфер (Invitrogen). Кроме того, нагрузка 5 мкл предварительно окрашенные белки размер маркера (например СТРАНИЦА правителя плюс, Fermentas, SM1811). Выполнить геля в течение 50 минут при 180 В. Удаление геля перед и отбросить, как твердые отходы (содержит свободные радиоактивные АТФ). Передача белка-РНК комплексов из геля на нитроцеллюлозные мембраны использованием Novex мокрых аппаратов передачи в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, передача 1 ч при 30 В). После передачи, промойте мембрану в буфере PBS, затем заверните его в Саран пленку и подвергать его фильм Fuji при -80 ° C (место флуоресцентные наклейки рядом с мембраной позже выровнять тОн пленкой и мембраной; выполнять экспозиции в течение 30 мин, 1 час и в течение ночи). 9. РНК изоляции Изолят белка-РНК комплексов из низких РНКазы эксперимент с использованием авторадиограмма с шагом 8.5, как маска. Вырезать этот кусок мембраны на несколько маленьких кусочков и положите их в 1,5 мл микропробирок. Добавьте 200 мкл буфера для ПК (100 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 50 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА) и 10 мкл протеиназы К (Roche, +03115828001), чтобы мембрана штук. Инкубируйте встряхивании при 1100 оборотов в минуту в течение 20 мин при 37 ° C. Добавить 200 мкл PKurea буфера (100 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 50 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 7 M мочевины) и инкубировать в течение 20 мин при 37 ° C. Сбор решение и добавить его вместе с 400 мкл РНК фенол / хлороформ (Амбион, 9722) до 2 мл ФАПЧ Гель Тяжелые трубы (713-2536, VWR). Инкубировать в течение 5 мин при 30 ° С, качая на 1100 оборотах в минуту. Отдельные фазы, крутя в течение 5 мин при 13000 оборотов в минуту при комнатной температуре. Передача водный слой в новую трубу (будьте осторожны, не прикасайтесь к гель с пипеткой). Добавить 0,5 мкл glycoblue (Амбион, 9510) и 40 мкл 3 М ацетата натрия рН 5,5 и перемешать. Затем добавить 1 мл 100% этанола, снова перемешать и выпадают в осадок в течение ночи при температуре -20 ° C. 10. Обратная транскрипция Спиновые течение 20 мин при 15000 оборотах в минуту и ​​4 ° C. Удалить супернатант и мыть гранул с 0,5 мл 80% этанола. Ресуспендируют пеллет в 7,25 мкл РНК / грунтовки смеси (6,25 мкл воды, 0,5 мкл праймера Rclip [0.5pmol/μl]; 0,5 мкл дНТФ смеси [10 мМ]). Для каждого эксперимента или тиражировать, использовать различные грунтовки Rclip содержащие отдельные последовательности штрих-кодов (см. 14). Инкубировать в течение 5 мин при 70 ° С до охлаждения до 25 ° C. Добавить 2,75 мкл RT смесь (2 мкл 5х буфера РТ; 0,5 мкл 0,1 М ДТТ; 0,25 мкл Надстрочный III обратной транскриптазы [Invitrogen]). Инкубировать 5 мин при 25 ° C, 20 мин при 42 ° С, 40 мин при 50 ° С и 5 мин при 80 ° C до охлаждения до 4 ° C. Добавить 90 мкл ТЕ-буфера, 0,5 мкл glycoblue и 10 мкл раствора ацетата натрия рН 5,5 и перемешать. Затем добавьте 250 мкл 100% этанола, снова перемешать и выпадают в осадок в течение ночи при температуре -20 ° C. 11. Гель очистки кДНК Спином вниз и мыть образцов (см. 10.1), то ресуспендирования гранул в 6 мкл воды. Добавить 6 мкл 2x КЭ-мочевины загрузки буфера (Invitrogen). Тепло образцов до 80 ° С в течение 3 мин непосредственно перед загрузкой. Нагрузка на образцы сборных 6% КЭ-мочевины гель (Invitrogen) и запустить в течение 40 мин при 180 В, как описано производителем. Кроме того, нагрузка низкой маркер молекулярного веса для последующей резки (см. ниже). Отрежьте три полосы при 120-200 нт (высокий), 85-120 нт (средний) и 70-85 нт (низкий). Используйте theupper красителя и следы на пластиковых поддержку гель для руководства иссечение (см. Рисунок 3). Обратите внимание, что грунтовка Rclip и последовательность L3 в совокупности приходится 52 нт из CLIP последовательности. Добавить 400 мкл ТЕ-и раздавить геля на мелкие части, используя 1 мл шприца. Инкубируйте встряхивании при 1100 оборотов в минуту в течение 2 ч при 37 ° C. Поместите два 1 см стекло предварительные фильтры (Whatman, 1823010) в колонке Costar SpinX (Corning Incorporated, 8161). Передача жидкой части образца к колонке. Спиновые в течение 1 мин при 13000 оборотов в минуту в 1,5 мл трубки. Добавить 0,5 мкл glycoblue и 40 мкл раствора ацетата натрия рН 5,5, затем смешайте образца. Добавьте 1 мл 100% этанола, снова перемешать и выпадают в осадок в течение ночи при температуре -20 ° C. 12. Лигирование грунтовке 5'end из кДНК Спином вниз и мыть образцов (см. 10.1), то ресуспендирования гранул в 8 мкл смеси лигирования (6,5 мкл воды, 0,8 мкл 10х буфера CircLigase II, 0,4 мкл 50 мМ MnCl 2; 0,3 мкл; Circligase II [Эпицентр]) и инкубировать в течение 1 часа при температуре 60 ° C. Добавить 30 мкл олиго отжига смеси (26 мкл воды, 3 мкл буфера FastDigest [Fermentas]; 1 мкл cut_oligo [10 мкМ]). Инкубируйте в течение 1 мин при 95 ° C. Затем уменьшите температуру каждые 20 сек на 1 ° С до 25 ° С были достигнуты. Добавить 2 мкл BamHI (Fast Fermentas) и инкубировать 30 минут при температуре 37 ° C. Добавить 50 мкл ТЕ-и 0,5 мкл glycoblue и перемешать. Добавьте 10 мкл рН раствора ацетата натрия 5,5 и перемешать, затем добавить 250 мкл 100% этанола. Смешайте снова и осадок в течение ночи при температуре -20 ° C. 13. ПЦР-амплификации Спином вниз и мыть образцов (см. 10.1), то ресуспендирования гранул в 19 мкл воды. Подготовьте смесь ПЦР (19 мкл кДНК; 1 мкл смеси грунтовка P5/P3 solexa, 10 мкм каждая, 20 мкл Accuprime Supermix 1 фермента [Invitrogen]). Выполните следующую программу ПЦР: 94 ° С в течение 2 мин, [94 ° С в течение 15 сек, 65 ° С в течение 30 сек, 68 ° С в течение 30 сек] 25-35 циклов, 68 ° С в течение 3 мин, 4 ° C навсегда. Смешать 8 мкл продукта ПЦР с 2 мкл 5х буфера загрузки КЭ и нагрузки на сборные 6% гель КЭ (InvitРоген). Пятно гель с Sybrgreen I (Invitrogen) и проанализировать с помощью геля тепловизор. Штрих-код в Rclip грунтовки позволяют мультиплекс различных образцов, прежде чем представить на высокой пропускной последовательности. Отправить 15 мкл библиотеки для секвенирования и хранить покой. 14. Компоновщика и грунтовки последовательностей Компоновщик Предварительно adenylated 3 'ДНК: [Мы заказываем ДНК адаптер от IDT, а затем сделать аликвоты 20 мкм.] 15. Представитель Результаты: До секвенирование библиотеки iCLIP, успех эксперимента может осуществляться на два этапа: авторадиограмма белка-РНК комплекса после мембраны передачи (шаг 8.5) и гель образ продуктов ПЦР (шаг 13.4). В авторадиограмма низко-РНКазы образцы, диффузный радиоактивности следует рассматривать выше молекулярная масса белка (рис. 2, пример 4). Для получения высокого РНКазы образцов, эта радиоактивность сосредоточена ближе к молекулярным весом белка (рис. 2, образец 3). При отсутствии антител используется в иммунопреципитации, сигнал не должен быть обнаружен (рис. 2, образцов 1 и 2). Другие важные элементы управления для специфики иммунопреципитации либо опустить УФ-облучения или использование клеток, которые не выражают белок 14. Гель образ продуктов ПЦР (шаг 13.4) должны показать диапазон размеров, который соответствует кДНК фракции (высокая, средняя или низкая) очищали в шаге 11,4 (рис. 4, дорожки 4-6). Обратите внимание, что ПЦР праймеры P3Solexa и P5Solexa ввести дополнительные 76 нт, чтобы размер кДНК. При отсутствии антител используется при иммунопреципитации, не соответствующих продуктов ПЦР должен быть обнаружен (рис. 4, дорожки 1-3). Продукт Primer димера может появиться около 140 нт. Для представителя результаты высокой пропускной последовательности и последующее биоинформатики анализов см. 14. Рисунок 1. Схематическое изображение протокол iCLIP. Белково-РНК комплексов ковалентно сшитых в естественных условиях с помощью УФ облучения (шаг 1). Белок очищается вместе со связанными РНК (шаги 2-5). Для обеспечения последовательности конкретных грунтования обратной транскрипции, адаптер РНК лигируют с 3 'конца РНК, в то время как 5' конец радиоактивно меченый (шаги 6 и 7). Сшитые белка-РНК комплексы очищают от свободной РНК с помощью SDS-PAGE и мембранных передачи (шаг 8). РНК выделяют из мембраны путем переваривания белка с протеиназы К оставляя полипептид, остающейся в поперечной связи нуклеотида (шаг 9). Обратной транскрипции (RT) усекает на остальных полипептида и вводит два расщепляемого регионах адаптер и штрих-код последовательностями (шаг 10). Размер выбора удаляет свободные грунтовки РТ до рассылке. Следующие линеаризации генерирует подходящие шаблоны для ПЦР (шаги 11-15). Наконец, высокой пропускной последовательности генерирует читает, в котором штрих-код последовательности сразу после последнего нуклеотида кДНК (шаг 16). Так как это нуклеотидных находит одну позицию вверх по течению от сшитого нуклеотид, сайт связывания может быть выведена с высоким разрешением. Рисунок 2. Авторадиограмма сшитого hnRNP C-РНК комплексов с использованием денатурирующих гель-электрофореза и мембранных передачи. hnRNP C-РНК комплексов иммуно-очищается от клеточных экстрактов использованием антител против hnRNP C (α hnRNP С, образцы 3 и 4). РНК частично переваренной использования низких (+) или высокого (+ +) концентрация РНКазы. Комплексы сдвиг вверх от размера белка (40 кДа) можно наблюдать (образец 4). Сдвиг менее выраженным, когда высокие концентрации РНКазы были использованы (образец 3). Радиоактивный сигнал исчезает, когда нет антител был использован в иммунопреципитации (образцы 1 и 2). Рисунок 3. Схема 6% КЭ-мочевины гель (Invitrogen) для руководства иссечение iCLIP кДНК продукции. Гель работать в течение 40 мин при 180 В, ведущих к воспроизводимой картины миграции кДНК и красителей (светло и темно-синий) в гель. Используйте лезвие, чтобы сократить (красная линия) высокой (H), средний (M), и низкого (L) кДНК фракций. Для начала резки в середине голубой краситель и непосредственно над отпечаток на пластиковые кассеты геля. Разделите средних и низких фракций и отделка высокой долей около 1 см выше голубой краситель. Используйте вертикальные разрезы руководствоваться карманы и красителей для разделения различных полос (в данном примере 1-4). Маркер полосы (м) могут быть окрашены и отображаемого для контроляразмеров после резки. Фрагмент размеры указаны справа. Рисунок 4. Анализ ПЦР-усиливается iCLIP кДНК библиотек с использованием гель-электрофореза. РНК оправился от мембраны (рис. 1) была обратной транскрипции и размер-очищали с использованием денатурирующих гель-электрофореза (рис. 2). Три размера доли кДНК (высокий [H]: 120-200 NT, среды [M]: 85-120 нт и низкой [L]: 70-85 нт) были восстановлены, circularized, повторно линеаризованной и ПЦР-усиливаются. ПЦР-продукты разных размер дистрибутива можно наблюдать в результате различных размеров входного фракций. Так как грунтовка ПЦР вводит 76 нт к кДНК, размеры должны составлять от 196-276 нт для высоких, 161-196 нт для средних и 146-161 нт для низких фракций размера. ПЦР-продукты отсутствуют при отсутствии антител был использован для иммунопреципитации (полосы 1-3).