iCLIP - Transcriptoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-RNA com a Resolução Nucleotide Individual

1. UV ligação cruzada de cultura de tecidos de células Remova a mídia e adicionar 6 ml gelada PBS para as células cultivadas em uma placa de 10 cm (o suficiente para três experimentos). Retire a tampa e colocar no gelo. Irradiar uma vez com 150 mJ / cm 2 a 254 nm. Colheita das células por raspagem com um levantador de células. Transferência de 2 ml de suspensão celular para cada uma das três microtubos. Giram em velocidade máxima por 10 segundos a 4 ° C para as células de pelotas, em seguida, remova o sobrenadante. Snap-congelar as bolinhas de células em gelo seco e armazenar a -80 ° C até o uso. 2. Preparação do grânulo Adicionar 100 ul de proteína A Dynabeads (Dynal, 100,02) por experimento para um microtubo fresco (Use Dynabeads proteína G para um mouse ou anticorpos de cabra). Lavar contas 2x com tampão (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS; desoxicolato de sódio 0,5%; 1 / 100 de inibidores da protease cocktail III, Calbiochem) lise. Ressuspender contas em 100 mL com tampão de lise 20-10 mg de anticorpos. Gire tubos à temperatura ambiente por 30-60 min. Lavar 3x com 900 mL tampão de lise e deixar na última lavagem, até estar pronto para avançar para o passo 4.1. 3. Lise celular e digestão parcial RNA Ressuspender o pellet celular em um tampão de lise ml e transferir para 1,5 ml microtubos. Prepare uma diluição de 1 / 500 da RNase I (Ambion, AM2295). Adicionar 10 ml de diluição RNase I, bem como 2 l Turbo DNase ao lisado celular (1 / 500 diluições RNase I [baixo RNase] são usados ​​para a preparação de biblioteca; 1 / 50 diluições [alta RNase] são necessárias para o controle para a especificidade de anticorpos) . Incubar as amostras para exatamente 3 minutos a 37 ° C, agitando a 1.100 rpm. Transferir imediatamente para o gelo. Girar a 4 ° C e 22.000 g por 20 min para limpar o lisado. Recolher com cuidado o sobrenadante (deixar cerca de 50 mL do lisado com a pelota). 4. Imunoprecipitação Remova o tampão de lavagem dos grânulos (a partir do passo 2.5), em seguida, adicione o lisado de células (do passo 3.4). Gire as amostras por 2 horas a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e lavar as contas 2x com 900 buffer de alta-sal mL (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 M NaCl; 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% desoxicolato de sódio). Lavar 2x com 900 tampão de lavagem (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl 2; 0,2% Tween-20) mL. 5. Desfosforilação de RNA 3'ends Descartar o sobrenadante e ressuspender as contas em 20 mix PNK mL (15 mL de água, 4 mL pH 6,5 PNK 5x buffer [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl 25mMdithiothreitol 2], 0,5 mL da enzima PNK, 0,5 mL RNasin [Promega]). Incubar por 20 min a 37 ° C. Adicionar 500 mL de tampão de lavagem e lavar 1x com alto-sal buffer. Lavar 2x com tampão de lavagem. 6. Ligadura vinculador a RNA 3 'termina Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender as contas em 20 mix ligadura mL (9 mL de água, 4 mL de buffer ligadura 4x [200 mMTris-HCl; MM 40m GCL 2; 40 ditiotreitol mM]; 1 ml RNA ligase [NEB], 0,5 mL RNasin [Promega]; 1,5 linker pré-adenylated mL L3 [20 mM], 4 mL PEG 400 [81170, Sigma]). Incubar durante a 16 ° C. Adicionar 500 mL de tampão de lavagem e depois lavar 2x com um buffer de alta-sal ml. Lavar 2x com 1 ml tampão de lavagem e deixar em 1 ml da segunda lavagem. 7. Rotulagem RNA extremidade 5 ' Remover o sobrenadante e ressuspender as contas em 8 mL de mistura quente PNK (0,4 mL PNK [NEB]; 0,8 mL 32 P-γ-ATP; 0,8 mL de buffer PNK 10x [NEB]; 6 mL de água). Incubar por 5 min a 37 ° C. Retire a mistura quente e PNK ressuspender as contas em 20 l de tampão de carregamento Nupage 1x (Invitrogen). Incubar em um Thermomixer a 70 ° C por 10 min. Coloque imediatamente em um ímã para precipitar as contas vazio e carregar o sobrenadante no gel (veja passo 8). 8. SDS-PAGE e transferência de membrana Carregar as amostras em um NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Use 0,5 l de tampão de corrida MOPS 1x (Invitrogen). Também carga de 5 mL de um marcador de tamanho pré-manchada de proteína (por exemplo PAGE governante plus, Fermentas, SM1811). Executar o gel por 50 min em 180 V. Remova o gel frente e descarte de resíduos sólidos (contém livre radioativos ATP). Transferência dos complexos de proteína-RNA do gel para uma membrana de nitrocelulose utilizando o aparelho de transferência Novex húmida de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, transferência de 1 hora a 30 V). Após a transferência, lavar a membrana em tampão PBS, em seguida, envolvê-la em saran wrap e expô-la a um filme Fuji a -80 ° C (colocar um adesivo fluorescente próxima à membrana para depois alinhar tele cinema e da membrana; realizar exposições por 30 min, 1h e durante a noite). 9. RNA isolamento Isolar os complexos de proteína-RNA a partir do experimento de baixo RNase usando o autoradiograph a partir do passo 8.5 como uma máscara. Corte este pedaço de membrana em várias fatias e coloque-os em um microtubo de 1,5 ml. Adicionar 200 mL de buffer PK (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA) e 10 ml proteinase K (Roche, 03115828001) para as peças de membrana. Incubar agitando a 1.100 rpm por 20 min a 37 ° C. Adicionar 200 mL de tampão PKurea (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA; 7 M uréia) e incubar por 20 min a 37 ° C. Coletar a solução e adicioná-lo juntamente com 400 mL de RNA de fenol / clorofórmio (Ambion, 9722) para uma Fase 2 ml de bloqueio do tubo Gel pesados ​​(713-2536, VWR). Incubar por 5 min a 30 ° C, agitando a 1.100 rpm. Separar as fases por fiação por 5 min a 13.000 rpm à temperatura ambiente. Transferir a fase aquosa para um novo tubo (cuidado para não tocar no gel com a pipeta). Adicionar 0,5 mL glycoblue (Ambion, 9510) e 40 mL 3 M pH 5,5 e acetato de sódio mix. Em seguida, adicione 1 ml de etanol 100%, misture novamente e precipitar durante a noite a -20 ° C. 10. Transcrição reversa Giro por 20 min a 15.000 rpm e 4 ° C. Remover o sobrenadante e lavar o pellet com 0,5 ml de etanol 80%. Ressuspender o sedimento em 7,25 mL de RNA / mix de primer (6,25 mL de água, 0,5 mL de primer Rclip [0.5pmol/μl], 0,5 mL de dNTP mix [10mM]). Para cada experiência ou replicar, use um primer Rclip diferentes contendo seqüências de códigos de barras individuais (ver 14). Incubar por 5 min a 70 ° C antes do resfriamento a 25 ° C. Adicionar 2,75 mL RT mix (2 mL tampão RT 5x, 0,5 mL 0,1 M DTT; 0,25 mL Sobrescrito III da transcriptase reversa [Invitrogen]). Incubar 5 min a 25 ° C, 20 min a 42 ° C, 40 min a 50 ° C e 5 min a 80 ° C antes do resfriamento a 4 ° C. Adicionar 90 mL tampão TE, 0,5 mL glycoblue e 10 mL de acetato de sódio pH 5,5 e misturar. Em seguida, adicione 250 mL de etanol 100%, misture novamente e precipitar durante a noite a -20 ° C. 11. Purificação em gel de cDNA Spin para baixo e lavar as amostras (ver 10.1), em seguida, voltar a suspender as pelotas em 6 mL de água. Adicionar 6 mL de tampão de carregamento 2x TBE-uréia (Invitrogen). Amostras de calor a 80 ° C por 3 min directamente antes de carregar. Carregar as amostras em um pré-moldado de 6% gel TBE-uréia (Invitrogen) e correr por 40 min a 180 V, conforme descrito pelo fabricante. Também carregar um marcador de baixo peso molecular de corte subseqüentes (veja abaixo). Corte três bandas em 120-200 nt (alto), 85-120 nt (médio) e 70-85 nt (baixo). Use theupper dye e as marcas com o apoio gel de plástico para guiar a excisão (ver Figura 3). Note-se que o primer Rclip ea seqüência L3, juntos, respondem por 52 nt da seqüência CLIP. Adicionar 400 mL de TE e esmagar a fatia de gel em pequenos pedaços usando uma um êmbolo da seringa ml. Incubar agitando a 1.100 rpm por 2 horas a 37 ° C. Coloque dois um centímetro de vidro pré-filtros (Whatman, 1.823.010) em uma coluna Spinx Costar (Corning Incorporated, 8161). Transferir a parte líquida da amostra para a coluna. Rodada por 1 min a 13.000 rpm em um tubo de 1,5 ml. Adicionar 0,5 mL glycoblue e 40 mL de acetato de sódio pH 5,5, em seguida, misturar a amostra. Adicionar 1 ml de etanol 100%, misture novamente e precipitar durante a noite a -20 ° C. 12. Ligadura de primer para o 5'end do cDNA Spin para baixo e lavar as amostras (ver 10.1), em seguida, voltar a suspender as pelotas em 8 mix ligadura mL (6,5 mL de água e 0,8 mL 10x CircLigase buffer II; 0,4 mL 50 mM MnCl 2; 0,3 mL; Circligase II [Epicentre]) e incubar por 1 hora a 60 ° C. Adicionar 30 mL de recozimento mix oligo (26 mL de água, 3 mL de buffer FastDigest [Fermentas]; 1 ml cut_oligo [10 mM]). Incubar por 1 min a 95 ° C. Então diminuir a temperatura a cada 20 segundos em 1 ° C até 25 ° C são atingidos. Adicione 2 mL BamHI (Fermentas Fast) e incubar por 30 min a 37 ° C. Adicionar 50 mL TE e 0,5 glycoblue mL e misturar. Adicionar 10 mL de acetato de sódio pH 5,5 e misture, em seguida, adicione 250 mL de etanol 100%. Misture novamente e precipitar durante a noite a -20 ° C. 13. Amplificação por PCR Spin para baixo e lavar as amostras (ver 10.1), em seguida, ressuspender o sedimento em 19 mL de água. Prepare a mistura de PCR (19 mL cDNA; 1 ml de primer mix P5/P3 Solexa, 10 mM cada; 20 mL Accuprime Supermix uma enzima [Invitrogen]). Execute o programa de PCR seguinte: 94 ° C por 2 min, [94 ° C por 15 segundos, 65 ° C por 30 segundos, 68 ° C por 30 segundos] 25-35 ciclos, 68 ° C por 3 min, 4 ° C para sempre. Mix 8 mL do produto PCR com 2 l de tampão TBE 5x de carga e de carga em um gel TBE pré-moldado de 6% (InvitRogen). Manchar o gel com Sybrgreen I (Invitrogen) e analisar com um gerador de imagens gel. O código de barras na primers Rclip permitem amostras multiplex diferente antes de enviar para o seqüenciamento de alto rendimento. Apresentar 15 mL da biblioteca para o seqüenciamento e armazenar o resto. 14. Seqüências Linker e primer DNA linker pré-adenylated 3 ': [Nós fim do adaptador de DNA a partir de IDT e fazer alíquotas de 20Hm.] 15. Resultados representativos: Antes de seqüenciamento da biblioteca iCLIP, o sucesso do experimento pode ser monitorado em duas etapas: a autoradiograph do complexo proteína-RNA após a transferência de membrana (passo 8.5) ea imagem gel dos produtos de PCR (passo 13.4). No autoradiograph das amostras de baixa RNase, a radioactividade difusa deve ser visto acima do peso molecular da proteína (Figura 2, amostra 4). De alta RNase amostras, a radioatividade é focado mais perto do peso molecular da proteína (Figura 2, amostra 3). Quando não há anticorpo é usado no imunoprecipitação, nenhum sinal devem ser detectados (Figura 2, as amostras 1 e 2). Mais importantes controles para a especificidade da imunoprecipitação ou omitir irradiação UV ou células uso que não expressam a proteína de interesse 14. A imagem do gel dos produtos de PCR (passo 13.4) deve mostrar uma faixa de tamanho que corresponde à fração de cDNA (alta, média ou baixa) purificada no passo 11.4 (Figura 4, faixas 4-6). Note que a PCR e primers P3Solexa P5Solexa introduzir um nt 76 adicionais para o tamanho do cDNA. Se nenhum anticorpo é usado durante a imunoprecipitação, nenhum produto correspondente PCR devem ser detectados (Figura 4, faixas 1-3). Produto dímero Primer pode aparecer em cerca de 140 nt. Para obter resultados representativos de high-throughput seqüenciamento e posterior análises de bioinformática ver 14. Figura 1. Representação esquemática do protocolo iCLIP. Proteína-RNA complexos são covalentemente cruzada in vivo utilizando irradiação UV (passo 1). A proteína de interesse é purificado, juntamente com o RNA ligado (passos 2-5). Para permitir priming seqüência específica de transcrição reversa, um adaptador de RNA é ligada à extremidade 3 'do RNA, enquanto que a extremidade 5' é marcado radioativamente (passos 6 e 7). Cross-linked proteína-RNA complexos são purificados a partir de RNA livre usando SDS-PAGE e transferência de membrana (passo 8). O RNA é recuperado a partir da membrana por digerir a proteína com proteinase K deixando um polipeptídeo remanescente no cross-link nucleotídeo (passo 9). Transcrição reversa (RT) trunca no polipeptídeo restantes e apresenta duas regiões adaptador clivável e sequências de código de barras (passo 10). Seleção de tamanho remove cartilha RT livre antes de circularização. A linearização seguir gera modelos adequados para a amplificação PCR (passos 11-15). Finalmente, high-throughput seqüenciamento gera lê na qual as seqüências de códigos de barras são imediatamente seguidos por último nucleotídeo do cDNA (passo 16). Uma vez que este nucleotídeo localiza uma posição a montante do nucleotídeo cruzada, o sítio de ligação pode ser deduzida com alta resolução. Figura 2. Autoradiograph de cross-linked hnRNP C-RNA complexos usando eletroforese em gel desnaturante e transferência de membrana. hnRNP C-RNA complexos foram imuno-purificada a partir de extratos de células usando um anticorpo contra hnRNP C (α hnRNP C, as amostras 3 e 4). RNA foi parcialmente digeridos com baixa (+) ou alta (+ +) concentração de RNase. Complexos deslocando para cima a partir do tamanho da proteína (40 kDa) pode ser observado (amostra 4). A mudança é menos pronunciado quando altas concentrações de RNase foram utilizados (amostra 3). O sinal radioativo desaparece quando não há anticorpos foi utilizado no imunoprecipitação (amostras 1 e 2). Figura 3. Esquemática 6% gel TBE-uréia (Invitrogen) para guiar a excisão de produtos iCLIP cDNA. O gel é executado por 40 min a 180 V levando a um padrão de migração reprodutível de cDNAs e corantes (luz e azul escuro) no gel. Use uma lâmina de barbear para cortar (linha vermelha) a alta (H), médio (M) e baixa (L) frações cDNA. Comece por cortar no meio do corante azul e imediatamente acima da marca na fita gel de plástico. Divide as frações de média e baixa e aparar a fração alta de cerca de 1 cm acima do corante azul claro. Use cortes verticais guiada pelo bolsos e o corante para separar as pistas diferentes (neste exemplo, 1-4). A pista marcador (m) pode ser manchado e fotografada para controlartamanhos após o corte. Tamanhos de fragmentos são indicados à direita. Figura 4. Análise de bibliotecas amplificado por PCR usando cDNA iCLIP eletroforese em gel. RNA recuperado da membrana (Figura 1) foi reverso transcrito e tamanho purificado utilizando eletroforese em gel desnaturante (Figura 2). Três frações de tamanho de cDNA (alta [H]: 120-200 nt, média [M]: 85-120 nt e de baixo [L]: 70-85 nt) foram recuperados, enviou notícias, re-linearizado e amplificado por PCR. Os produtos de PCR de distribuição de tamanho diferente pode ser observada como resultado dos tamanhos diferentes das frações de entrada. Uma vez que o primer PCR apresenta 76 nt para o cDNA, tamanhos deve variar entre 196-276 nt para alto, 161-196 nt para empresas de médio e 146-161 nt para frações tamanho reduzido. Os produtos de PCR estão ausentes quando nenhum anticorpo foi utilizado para a imunoprecipitação (faixas 1-3).