iCLIP - 개인 염기 해상도와 단백질 RNA 상호 작용의 Transcriptome 전체 매핑

1. UV 교차 연결 조직 문화의 세포 미디어를 제거하고 10cm 접시 (충분한 세 실험)에 성장 세포 6 ML 얼음처럼 차가운 PBS를 추가합니다. 얼음 뚜껑과 장소를 제거합니다. 150 254 NM에서 MJ / cm 2 번 비추다. 휴대 리프터와 스크레이핑하여 세포를 수확. 세 microtubes 각각 2 ML 세포 현탁액을 전송합니다. 4 10 초에 대한 최고 속도로 회전은 ° C 펠릿 세포에 다음 뜨는 제거합니다. 스냅 – 냉동 -80에서 드라이 아이스와 저장소에 셀 알약을 ° C까지 사용. 2. 비드 준비 100 μl의 단백질 새로운 microtube로 실험을 당 Dynabeads (Dynal, 100.02) (마우스 또는 염소 항체에 대한 단백질 G의 Dynabeads를 사용). 추가 . 용해 완충액 (; 100 MM NaCl, 1퍼센트 NP – 40, 0.1 % SDS, 0.5 %의 나트륨 deoxycholate, 1백분의 1 프로 테아제 억제제 칵테일 III, Calbiochem 50 MM 트리스 – HCL, pH를 7.4)로 2 배 구슬 와시 20-10 μg 항체 100 μl 용해 버퍼에 구슬을 Resuspend. 30-60 분 실온에서 튜브를 회전합니다. 900 μl 용해 버퍼 배 세척하고 4.1 단계로 진행 준비가 될 때까지 마지막으로 씻어 둡니다. 3. 세포 용해 및 일부 RNA의 소화 1 ML의 용해 버퍼와 1.5 ML의 microtubes로 전송에서 세포 펠렛을 Resuspend. RNase I (앰비온, AM2295)의 500분의 1 희석을 준비합니다. 10 μl RNase I 희석뿐만 아니라 세포 lysate 2 μl 터보 DNase 추가 (500분의 1 RNase I의 dilutions [낮은 RNase] 도서관 준비에 사용되며 50분의 1 dilutions [높은 RNase] 항체 특이성에 대한 제어하는​​ 데 필요한) . 37 정확히 3 분 ° C, 1100 rpm으로 흔들어에 대한 샘플을 품어. 즉시 얼음으로 전송할 수 있습니다. 4 스핀 ° C 및 lysate를 지우 20 분 2만2천그램. 조심스럽게 (펠렛과 함께 약 50 μl lysate를 떠나) 표면에 뜨는를 수집합니다. 4. Immunoprecipitation 비즈 (단계 2.5에서)에서 씻어 버퍼를 제거 후 세포 lysate를 (단계 3.4에서) 추가합니다. 4 2 H에 대한 샘플을 회전 ° C. 뜨는을 취소하고 900 μl 높은 소금 버퍼 (50 MM 트리스 – HCL, pH를 7.4, 1 M NaCl, 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1% NP – 40, 0.1 % SDS, 0.5 %의 나트륨 deoxycholate)로 2 배 비즈 씻으십시오. . 900 μl 세척 버퍼 (; 10 MM MgCl 2; 0.2 % 트윈 – 20 20 MM 트리스 – HCL, pH를 7.4)로 2 배 씻으십시오 5. RNA 3'ends의 Dephosphorylation 뜨는을 취소하고 (15 μl 물, 4 μl 배 PNK의 산도 6.5 버퍼 [350mMTris – HCL, pH를 6.5; 50mMMgCl이 25mMdithiothreitol]; 0.5 μl PNK 효소, 0.5 μl RNasin [Promega]) 20 μl PNK 믹스의 구슬을 resuspend. 37 20 분 품어 ° C. 500 μl 세척 버퍼를 추가하고 높은 소금 버퍼 1X 씻는다. 세척 버퍼와 2X 씻으십시오. 6. 3 '끝을 RNA에 결합 링커 조심스럽게 뜨는을 제거하고 (9 μl 물을 20 μl 내고 믹스의 구슬을 resuspend, 4 μl 4X 내고 버퍼 [200 mMTris – HCL, 40m의 MM gCl 2; 40 MM의 dithiothreitol], 1 μl RNA ligase [코]; 0.5 μl RNasin [Promega]; 1.5 μl 사전 adenylated 링커 L3 [20 μm의], 4 μl PEG400 [81170, 시그마]). 16 밤새 품어 ° C. 500 μl 세척 버퍼를 추가하고 다음 1 ML 높은 소금 버퍼 2X 씻으십시오. 두 번째 세척 1 ML 1 ML 세척 버퍼와 2X하고 떠나 씻으십시오. 7. RNA 5 '끝 라벨 뜨는를 제거하고 뜨거운 PNK 믹스 8 μl의 구슬을 resuspend (0.4 μl PNK [코]; 0.8 μl 32 P – γ – ATP, 0.8 μl 10X PNK 버퍼 [코]; 6 μl 물). 37 5 분 품어 ° C. 핫 PNK 믹스를 제거하고 20 μl의 1X Nupage 로딩 버퍼 (Invitrogen)에있는 구슬을 resuspend. ° C 10 분 70시 thermomixer에 품어. 즉시 (8 단계 참조) 빈 구슬을 촉진하고 겔에 뜨는를 로드할 자석에 놓으십시오. 8. SDS – PAGE와 막 전송 4~12%의 NuPAGE 제조 업체의 지시에 따라 BIS – 트리스 젤 (Invitrogen)에 샘플을로드합니다. 버퍼 (Invitrogen)를 실행 1X 맙스 0.5 리터를 사용합니다. 또한 사전에 묻은 단백질의 크기 표시 (예 : 페이지의 통치자 또한, Fermentas, SM1811) 5 μl를로드합니다. 180 50 분 겔을 실행 V. 겔 전면을 제거하고 고체 폐기물 (무료 방사성 ATP를 포함)로 폐기. 젤의 제조 업체의 지침 (Invitrogen, 30 V에서 환승 1 H)에 따라 Novex 서부 유럽 표준시 전송 장치를 사용하여 nitrocellulose 막에 단백질 RNA의 단지를 전송합니다. 전송 후, PBS 버퍼에 막을 린스, 다음 사란 포장에 포장하여 -80 ° C (장소 나중에 T를 정렬하기 위해 막 옆에 형광 스티커를에서 후지 필름에 노출그는 영화와 막이;) 30 분, 1 시간 및 밤 동안에 대한 노출을 수행합니다. 9. RNA 분리 마스크로 단계 8.5에서 autoradiograph를 사용하여 낮은 RNase 실험에서 단백질 RNA의 단지를 분리. 여러 개의 작은 조각으로 막 조각을 잘라 1.5 ML의 microtube에 그들을 놓으십시오. 막 조각을 10 μl proteinase K (로체, 03,115,828,001) 200 μl PK 버퍼를 (10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산),, 50 MM 100 MM NaCl 트리스 – HCL의 산도 7.4) 추가합니다. 37 20 분 1,100 rpm으로 흔들어 품어 ° C. PKurea 버퍼 (; 50 MM NaCl, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 100 MM 트리스 – HCL pH는 7.4 7 M 우레아) 200 μl를 추가하고 37에서 20 분 품어 ° C. 솔루션을 수집하고 2 ML 단계 잠금 젤 중공업 튜브 (713-2536, VWR)에 클로로포름 (앰비온, 9722) / 페놀 RNA 400 μl와 함께 추가합니다. 1,100 RPM에 떨고, 30 5 분 ° C에 대해 품어. 실온에서 13,000 rpm으로 5 분 회전으로 ​​단계를 구분한다. (피펫로 젤을 만지지 않도록주의) 새로운 튜브로 수성 레이어를 전송합니다. 0.5 μl glycoblue (앰비온, 9510) 40 μl 3 M의 아세트산 나트륨의 산도 5.5와 혼합을 추가합니다. 다음 1 ML 100 % 에탄올을 추가, -20 ° C. 밤 동안 다시 믹스 및 촉진 10. 역방향 전사 15,000 RPM 4 20 분 스핀 ° C. 뜨는을 제거하고 0.5 ML 80 % 에탄올로 펠렛을 씻으십시오. . 7.25 μl RNA / 프라이머 믹스 (; 0.5 μl Rclip 프라이머 [0.5pmol/μl]; 0.5 μl dNTP 혼합 [10mM] 6.25 μl 물)의 펠릿을 Resuspend 각각의 실험이나 복제를위한 개별 바코드 시퀀스 (14 참조) 포함된 다른 Rclip의 프라이머를 사용합니다. 70 5 분 품어 ° C 25 ° C.으로 냉각하기 전에 2.75 μl RT 혼합 (; 0.5 μl 0.1M DTT, 0.25 μl 윗첨자 III 반전 transcriptase [Invitrogen] 2 μl RT 배 버퍼)를 추가합니다. 25 5 분 품어 ° C, 42시 20 분 ° C, 50 ° C 40 분 80시 5 분 ° C 4 냉각하기 전에 ° C. 90 μl TE 버퍼, 0.5 μl glycoblue 10 μl 아세트산 나트륨의 산도 5.5와 혼합을 추가합니다. 그렇다면 250 μl 100 % 에탄올을 추가, -20 ° C. 밤 동안 다시 믹스와 촉진 11. cDNA의 젤 정화 스핀 다운 및 (10.1 참조) 샘플을 씻어 후, 물 6 μl의 알약을 resuspend. 6 μl 2X TBE – 요소 로딩 버퍼 (Invitrogen)를 추가합니다. 열 샘플 80 ° C 직접적으로로드하기 전에 3 분. 프리 캐스트 6% TBE – 요소 젤 (Invitrogen)에 샘플을로드하고 같은 제조 업체에서 설명한 180 V에서 40 분 동안 실행. 또한 이후의 절단 (아래 참조)에 대한 낮은 분자량 마커를로드합니다. 120-200 NT (높이), 85-120 NT (중간)와 70-85 NT (낮은) 세 밴드 컷. (그림 3 참조) 절단을 안내 theupper 염료 및 플라스틱 겔 지원 부호를 사용하십시오. 참고 클립 순서의 52 NT 용 Rclip 프라이머와 함께 L3 순서 계정입니다. 400 μl TE를 추가하고 1 ML의 주사기의 플런저를 사용하여 작은 조각으로 겔 슬라이스를 부술. 37 2 H 위해 1,100 rpm으로 흔들어 품어 ° C. 플레이스 코스타 SpinX 칼럼 (코닝 설립, 8161)에이 1cm 유리 사전 필터 (왓먼, 1823010). 그 결과 해당 컬럼에 대한 샘플의 액체 부분을 전송합니다. 1.5 ML 튜브에 13,000 RPM에서 1 분 스핀. 0.5 μl glycoblue 40 μl 아세트산 나트륨의 산도 5.5를 추가 후 샘플을 섞는다. 1 ML 100 % 에탄올을 추가, -20 ° C. 밤 동안 다시 믹스 및 촉진 12. cDNA의 5'end에 뇌관을 내고 그리고 부화 스핀 다운과 (10.1 참조) 샘플을 씻어 후 8 μl 내고 믹스 (; 0.8 μl 10X CircLigase 버퍼 II, 0.4 μl 50 MM MnCl 2;, 0.3 μl Circligase II [Epicentre] 6.5 μl 물)의 알약을 resuspend 60 ° C. 1 H에 대한 30 μl oligo 소둔 혼합 추가 (26 μl 물, 3 μl FastDigest 버퍼 ​​[Fermentas], 1 μl cut_oligo [10 μm의]). 95에서 1 분 품어 ° C. 그렇다면 1 매 20 초 온도를 감소 ° C 25 ° C까지 도달하고 있습니다. 37 2 μl BamHI (고속 Fermentas) 30 분 품어 ° C. 추가 50 μl TE 및 0.5 μl glycoblue 및 혼합을 추가합니다. 10 μl 아세트산 나트륨의 산도 5.5 믹스를 추가한 다음 250 μl 100 % 에탄올을 추가합니다. -20 ° C. 밤 반복 및 석출물 믹스 13. PCR 증폭 스핀 다운 및 (10.1 참조) 샘플을 씻어 후, 19 μl 물에 펠렛을 resuspend. (, 1 μl 입문서 믹스 P5/P3 solexa, 10 μm의 각, 20 μl Accuprime Supermix 한 효소 [Invitrogen] 19 μl cDNA)를 PCR 믹스를 준비합니다. 다음 PCR 프로그램을 실행 25-35 사이클, 68 ° 3 분위한 C, 4 [30 초에 대한 94 ° C 15 초, 65 ° C를위한 30 초, 68 ° C] 94 ° C 2 분을 ° C 영원히. 프리 캐스트 6% TBE 젤에 배 TBE 로딩 버퍼와 부하 2 μl (Invit 8 μl PCR 제품 믹스로겐). Sybrgreen I (Invitrogen)로 겔 스테인과 젤 영상기와 함께 분석합니다. Rclip의 primers의 바코드는 높은 처리량 시퀀싱을 위해 제출하기 전에 다른 멀티 플렉스 샘플 수 있습니다. 시퀀싱을위한 라이브러리 15 μl를 제출하고 나머지를 저장합니다. 14. 링커 및 프라이머 시퀀스 사전 adenylated 3 '링커 DNA : [우리는 20μM의 aliquots을 다음 IDT의 DNA 어댑터를 주문합니다.] 15. 대표 결과 : 전에 iCLIP 라이브러리의 순서로 실험의 성공은 두 단계에서 모니터할 수 있습니다 : 멤브레인 전송 후 단백질 RNA 복합 (단계 8.5) 및 PCR 제품의 겔 이미지 (단계 13.4)의 autoradiograph합니다. 낮은 RNase 샘플 autoradiograph에서 확산 방사능은 단백질 (그림 2, 샘플 4)의 분자량 위에 볼 수 있습니다. 높은 RNase 샘플의 경우,이 방사능은 가까운 단백질의 분자량 (그림 2, 샘플 3) 초점을 맞추고 있습니다. 어떤 항체가 immunoprecipitation에 사용하지 않은 경우, 어떤 신호는 (그림 2 샘플 1과 2) 감지되지 않을 것입니다. immunoprecipitation의 특이성에 대한 더 중요한 컨트롤 UV 방사선이나 관심 14 단백질을 표현하지 사용 세포를 생략하거나. PCR 제품 (13.4 단계)의 겔 이미지는 단계 11.4 (그림 4 차선 4-6)에 정화 cDNA 분율 (높은, 중간 또는 낮은)에 해당하는 크기 범위를 표시합니다. PCR primers P3Solexa과 P5Solexa은 cDNA의 크기에 추가 76 NT를 소개합니다. 어떤 항체가 immunoprecipitation 동안 사용하지 않으면, 해당하는 PCR 제품은 (그림 4 차선 1-3) 감지되지 않을 것입니다. 프리머 이합체 제품은 약 140 NT에서 나타날 수 있습니다. 높은 처리량 시퀀싱 및 후속 bioinformatic 분석의 대표적인 결과를 얻으려면 14을 참조하십시오. 그림 1. iCLIP 프로토콜의 도식 표현. 단백질 RNA의 단지는 자외선 조사 (1 단계)를 사용하여 생체내에 covalently을 상호 연결되어 있습니다. 관심의 단백질은 바운드 RNA (단계 2-5)와 함께 정화됩니다. 최종 radioactively (6 단계와 7 단계)로 표시됩니다 반대로 전사의 순서를 특정 마중물 수 있도록, RNA 어댑터 '는 5 반면, RNA의 끝'가 3 출혈도 잡았입니다. 교차 연결된 단백질 RNA의 단지는 SDS – PAGE와 멤브레인 전송 (8 단계)를 사용하여 무료로 RNA의 정화입니다. RNA는 proteinase K는 염기 상호 링크 (9 단계)에 남아있는 polypeptide를 떠나있는 단백질을 소화하여 멤브레인에서 발견한 것입니다. 역방향 전사 (RT)는 남아있는 polypeptide로 잘라 두 cleavable 어댑터 지역 및 바코드 시퀀스 (10 단계)을 소개합니다. 크기 선택 circularization 전에 무료 RT의 뇌관을 제거합니다. 다음 선형화은 PCR의 증폭에 적합 템플릿 (11-15 단계)를 생성합니다. 마지막으로, 높은 처리량 시퀀싱은 바코드 시퀀스 즉시 (단계 16) cDNA의 마지막 염기 뒤에있는 읽기를 생성합니다. 교차 연결된 뉴클레오 티드의 상류이 뉴클레오 티드 찾아 한 위치 때문에, 바인딩 사이트는 고해상도로 유추하실 수 있습니다. 그림 2. 교차 연결된 hnRNP C – RNA의 단지의 Autoradiograph은 denaturing 겔 전기 영동과 막 전송을 사용합니다. hnRNP C – RNA의 단지가 hnRNP C에 대한 항체를 사용하여 세포 추출물에서 단백질 정화되었습니다 (α hnRNP C, 샘플 3, 4). RNA가 부분적으로 낮은 (+) 또는 높은를 사용하여 소화했다 (+ +) RNase의 농도. 단백질의 크기 (40 KDA)에서 이상 이동 단지는 (예제 4) 볼 수 있습니다. RNase의 높은 농도가 (예제 3) 사용했을 때 변화가 덜 발음됩니다. 어떤 항체가 (예제 1과 2) immunoprecipitation에서 사용하지 때 방사성 신호가 사라집니다. 그림 3. 도식 6% TBE – 요소 젤 (Invitrogen)는 iCLIP cDNA 제품의 절단 안내합니다. 겔은 겔에 cDNAs 및 염료 (파란색 조명과 어두운)의 재현성 마이 그 레이션 패턴 최고 180 V에서 40 분 동안 실행됩니다. (빨간색 선) 고 (H), 중간 (M), 낮은 (L) cDNA 분수를 잘라 면도날을 사용합니다. 플라스틱 겔 카세트에 하늘색 염료의 중간에 즉시 마르크 이상 절단하여 시작하십시오. 매체 낮은 분수를 분할하고 하늘색 염료 위 1cm에 대한 높은 분수를 좀 잘라. 다른 차선을 (이 예제 1-4)를 별도로 주머니와 염색으로 보이는 수직 상처를 사용하십시오. 마커 레인 (m)는 스테인드하고 제어하는​​ 데 몇 군데 있습니다절단 후 크기. 조각 크기는 오른쪽에 표시됩니다. 그림 4. 겔 전기 영동을 사용하여 PCR – 증폭된 cDNA 라이브러리 iCLIP 분석. RNA는 반대로 베꼈는데 및 크기 정화가 denaturing 겔 전기 영동 (그림 2)를 사용했던 멤브레인 (그림 1)에서 복구. 세 크기 분수 cDNA (높은 [H] : 120-200 NT, 매체는 [M] : 85-120 NT와 낮은 [L] : 70-85 NT) 복구되었습니다, circularized, 다시 선형 및 PCR – 증폭. 다양한 크기의 배포판의 PCR 제품은 입력 분수의 다양한 크기의 결과로 볼 수 있습니다. PCR 프라이머의 cDNA 76 NT를 도입 이래, 크기는 중간 및 낮은 크기의 분수에 대한 146-161 NT 높은, 161-196 NT 용 196-276 NT 사이의 범위해야합니다. 어떤 항체가 immunoprecipitation (1-3 차선)에 대한 사용되지 때 PCR 제품은 결석합니다.