iClip - transcriptome à l'échelle de cartographie des protéines-ARN Interactions avec résolution nucléotides individuels

1. UV réticulation des cellules de culture tissulaire Retirez le papier et ajouter 6 ml PBS glacé aux cellules cultivées dans une plaque de 10 cm (pour trois expériences). Retirer le couvercle et placer sur la glace. Irradier une fois avec 150 mJ / cm 2 à 254 nm. Récolter les cellules en grattant avec un lifter cellule. Transfert 2 ml de suspension cellulaire à chacun des trois microtubes. Spin à toute vitesse pendant 10 secondes à 4 ° C pour sédimenter les cellules, puis retirer le surnageant. Snap-geler les culots cellulaires sur la glace sèche et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation. 2. La préparation de billes Ajouter 100 ul de la protéine A Dynabeads (Dynal, 100,02) par expérience pour un microtube frais (Utilisez la protéine G Dynabeads pour une souris ou d'anticorps de chèvre). Lavez perles 2x avec un tampon de lyse (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS; désoxycholate de sodium à 0,5%; 1 / 100 inhibiteur de protéase cocktail III, Calbiochem). Remettre les billes dans 100 ul de tampon de lyse avec 2-10 anticorps ug. Rotation des tubes à température ambiante pendant 30-60 min. Laver 3x avec 900 ul de tampon de lyse et laisser dans le dernier lavage avant d'être prêt à passer à l'étape 4.1. 3. Lyse cellulaire et digestion partielle ARN Reprendre le culot cellulaire dans du tampon de lyse 1 ml et transférer à microtubes de 1,5 ml. Préparer une dilution 1 / 500 de la RNase I (Ambion, AM2295). Ajouter 10 ul RNase I dilution ainsi que 2 pl Turbo DNase au lysat cellulaire (1 / 500 RNase dilutions I [faible RNase] sont utilisées pour la préparation de la bibliothèque; 1 / 50 dilutions [haute RNase] sont nécessaires pour contrôler la spécificité des anticorps) . Incuber les échantillons pendant exactement 3 minutes à 37 ° C, en agitant à 1100 rpm. Immédiatement transfert à glace. Centrifuger à 4 ° C et 22 000 g pendant 20 min pour effacer le lysat. Recueillir soigneusement le surnageant (laisser environ 50 ul de lysat avec le culot). 4. Immunoprécipitation Retirez le tampon de lavage des billes (de l'étape 2.5), puis ajouter le lysat cellulaire (de l'étape 3.4). Tournez les échantillons pendant 2 h à 4 ° C. Jeter le surnageant et laver les billes de 2x avec 900 pi de haut-sel tampon (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 1 M de NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% de désoxycholate). Laver 2x avec 900 ul de tampon de lavage (20 mM Tris-HCI, pH 7,4, 10 mM MgCl 2, 0,2% de Tween-20). 5. La déphosphorylation des extrémités 3 'ARN Jeter le surnageant et remettre les billes en 20 PNK mélangez ul (15 ul d'eau; 4 pl pH 6,5 5x PNK buffer [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl 2 25mMdithiothreitol]; 0,5 ul enzyme PNK; 0,5 ul RNasine [Promega]). Incuber pendant 20 min à 37 ° C. Ajouter 500 ul de tampon de lavage et laver 1x avec forte teneur en sel tampon. Laver 2x avec un tampon de lavage. 6. Ligature Linker à l'ARN extrémités 3 ' Retirez délicatement le surnageant et remettre les billes en 20 mélange de ligature ul (9 ul d'eau, 4 pi de tampon ligature 4x [200 mMTris-HCl; MM 40m GCL 2; 40 mM de dithiothréitol]; 1 pl ARN ligase [ONE]; 0,5 RNasine ul [Promega]; 1,5 ul pré-adenylated linker L3 [20 uM]; 4 pl PEG400 [81170, Sigma]). Incuber une nuit à 16 ° C. Ajouter 500 ul de tampon de lavage, puis lavez 2x avec 1 ml de haute sel tampon. Laver 2x avec 1 ml de tampon de lavage et laisser dans 1 ml de la deuxième lavage. 7. Étiquetage fin ARN 5 ' Retirer le surnageant et remettre les billes en 8 ul du PNK mélange à chaud (0,4 pi PNK [ONE]; 0,8 ul 32 P-γ-ATP, 0,8 ul de tampon 10x PNK [ONE]; eau 6 pi). Incuber pendant 5 min à 37 ° C. Retirer le mélange PNK chaud et remettre en suspension les perles dans 20 tampon 1x chargement ul NuPAGE (Invitrogen). Incuber sur un thermomixer à 70 ° C pendant 10 min. Immédiatement placer sur un aimant pour précipiter les perles vide et charger le surnageant sur le gel (voir étape 8). 8. SDS-PAGE et transfert sur membrane Charger les échantillons sur un NuPAGE 4-12% de Bis-Tris gel (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. Utiliser 0,5 L de 1x MOPS courir tampon (Invitrogen). Également charger 5 pi d'un marqueur pré-teint protéine de taille (par exemple la règle PAGE plus, Fermentas, SM1811). Exécutez le gel pendant 50 min à 180 V. Retirer le gel de l'avant et jeter les déchets solides (contient gratuitement ATP radioactif). Transfert des complexes protéines-ARN à partir du gel d'une membrane de nitrocellulose en utilisant l'appareil de transfert Novex humide selon les instructions du fabricant (Invitrogen, transférer 1 h à 30 V). Après le transfert, rincer la membrane dans du tampon PBS, puis l'envelopper dans du Saran Wrap et de l'exposer à un film Fuji à -80 ° C (placer un autocollant fluorescent à côté de la membrane pour l'aligner tqu'il film et la membrane; effectuer des expositions pendant 30 min, 1h et plus la nuit). 9. Isolement de l'ARN Isoler les complexes protéines-ARN à partir de l'expérience à faible RNase en utilisant l'autoradiographie de l'étape 8.5 comme un masque. Couper ce morceau de membrane en plusieurs petites tranches et les placer dans un microtube de 1,5 ml. Ajouter 200 ul de tampon PK (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM de NaCl, 10 mM d'EDTA) et 10 pl protéinase K (Roche, 03115828001) pour les morceaux de membrane. Incuber en agitant à 1100 rpm pendant 20 min à 37 ° C. Ajouter 200 pl de tampon PKurea (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM de NaCl, 10 mM EDTA, 7 M d'urée) et incuber pendant 20 min à 37 ° C. Recueillir la solution et l'ajouter avec 400 pi de phénol / chloroforme (Ambion, 9722) à une phase 2 ml de gel de verrouillage du tube lourd (713 à 2536, VWR) ARN. Incuber pendant 5 min à 30 ° C, en agitant à 1100 rpm. Séparer les phases en faisant tourner pendant 5 min à 13000 rpm à température ambiante. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube (attention à ne pas toucher le gel avec la pipette). Ajouter 0,5 ul glycoblue (Ambion, 9510) et 40 pi 3 M pH acétate de sodium 5,5 et mélanger. Puis ajoutez 1 ml d'éthanol à 100%, mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C. 10. La transcription inverse Spin pendant 20 min à 15000 rpm et 4 ° C. Enlever le surnageant et laver le culot avec 0,5 ml d'éthanol à 80%. Reprendre le culot dans 7,25 ARN ul / mélange d'amorces (6,25 pi d'eau, 0,5 apprêt Rclip ul [0.5pmol/μl]; 0,5 ul de dNTP mix [10 mm]). Pour chaque expérience ou de reproduire, utiliser un apprêt Rclip différents contenant des séquences de codes à barres individuel (voir 14). Incuber pendant 5 min à 70 ° C avant de refroidir à 25 ° C. Ajouter 2,75 ul RT mélange (2 ul de tampon 5x RT; 0,5 ul DTT 0,1 M; 0,25 ul Exposant III de la transcriptase inverse [Invitrogen]). Incuber 5 min à 25 ° C, 20 min à 42 ° C, 40 min à 50 ° C et 5 min à 80 ° C avant de refroidir à 4 ° C. Ajouter 90 ul de tampon TE, 0,5 glycoblue ul et 10 ul d'acétate de sodium pH 5,5 et mélanger. Puis ajouter 250 ul d'éthanol à 100%, mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C. 11. Purification sur gel d'ADNc Isoler et laver les échantillons (voir 10.1), puis remettre en suspension les boulettes dans 6 pl d'eau. Ajouter 6 ul de tampon de chargement 2x TBE-urée (Invitrogen). Échantillons de chaleur à 80 ° C pendant 3 min avant de le charger directement. Charger les échantillons sur un préfabriqué 6% TBE-urée gel (Invitrogen) et courir pendant 40 min à 180 V comme décrit par le fabricant. Également charger un marqueur de faible poids moléculaire pour le découpage ultérieur (voir ci-dessous). Couper trois bandes à 120-200 NT (élevé), de 85 à 120 nt (moyen) et 70 à 85 nt (basse). Utilisez theupper colorant et les marques sur le support de gel de plastique afin de guider l'excision (voir Figure 3). Notez que l'amorce et la séquence Rclip L3 représentent ensemble 52 nt de la séquence de CLIP. Ajouter 400 ul de TE et écraser la tranche de gel en petits morceaux à l'aide d'un piston de seringue 1 ml. Incuber en agitant à 1100 rpm pendant 2 h à 37 ° C. Placer deux de 1 cm de verre pré-filtres (Whatman, 1.823.010) dans une colonne Costar SpinX (Corning Incorporated, 8161). Transfert de la partie liquide de l'échantillon à la colonne. Spin pendant 1 min à 13000 rpm dans un tube de 1,5 ml. Ajouter 0,5 glycoblue ul et 40 ul d'acétate de sodium pH 5,5, puis mélanger l'échantillon. Ajouter 1 ml d'éthanol à 100%, mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C. 12. Ligature d'apprêt à l'extrémité 5 'de l'ADNc Isoler et laver les échantillons (voir 10.1), puis remettre en suspension les boulettes dans huit mélange de ligature ul (6,5 ul d'eau, 0,8 ul de tampon 10x CircLigase II; 0,4 pi 50 mM MnCl2; 0,3 ul; Circligase II [Epicentre]) et incuber pendant 1 h à 60 ° C. Ajouter 30 ul mélange d'oligo recuit (26 ul d'eau, 3 tampons FastDigest ul [Fermentas]; 1 pl cut_oligo [10 pM]). Incuber 1 min à 95 ° C. Puis baisser la température toutes les 20 sec de 1 ° C jusqu'à 25 ° C sont atteints. Ajouter 2 ul BamHI (Fast Fermentas) et incuber pendant 30 min à 37 ° C. Ajouter 50 ul de TE et 0,5 glycoblue ul et mélanger. Ajouter 10 ul d'acétate de sodium pH 5,5 et mélanger, puis ajouter 250 ul d'éthanol à 100%. Mélanger à nouveau et le précipité pendant la nuit à -20 ° C. 13. L'amplification par PCR Isoler et laver les échantillons (voir 10.1), puis remise en suspension le culot dans 19 ul d'eau. Préparer le mélange de PCR (19 ul d'ADNc; 1 pl apprêt mélangez P5/P3 Solexa, 10 uM de chacun; 20 Accuprime ul Supermix une enzyme [Invitrogen]). Exécutez le programme PCR suivant: 94 ° C pendant 2 min, [94 ° C pendant 15 sec, 65 ° C pendant 30 sec, 68 ° C pendant 30 sec] 25-35 cycles, 68 ° C pendant 3 min, 4 ° C pour toujours. Mélanger 8 produit ul PCR avec 2 pi de tampon TBE chargement 5x et charge sur un gel de TBE préfabriqué 6% (InvitRogen). Tache le gel avec SybrGreen I (Invitrogen) et d'analyser avec un imageur de gel. Le code-barres dans les amorces Rclip permettent à des échantillons de différents multiplex avant de soumettre pour le séquençage à haut débit. Soumettez 15 ul de la bibliothèque pour le séquençage et de stocker le reste. 14. Des séquences de liaison et de l'amorce ADN lieur Pré-adenylated 3 ': [Nous commandons l'adaptateur d'ADN de IDT et ensuite faire des aliquotes de 20μM.] 15. Les résultats représentatifs: Avant de séquençage de la bibliothèque iClip, le succès de l'expérience peuvent être surveillés à deux étapes: l'autoradiographie du complexe protéine-ARN, après transfert sur membrane (étape 8.5) et l'image du gel des produits de PCR (étape 13.4). Dans l'autoradiographie des échantillons à faible RNase, la radioactivité diffuse doit être considéré au-dessus du poids moléculaire de la protéine (figure 2, l'échantillon 4). Pour haute RNase échantillons, cette radioactivité est concentrée près de la masse moléculaire de la protéine (figure 2, l'échantillon 3). Si aucun anticorps n'est utilisé dans l'immunoprécipitation, aucun signal doit être détecté (figure 2, les échantillons 1 et 2). D'autres commandes importantes pour la spécificité de l'immunoprécipitation omettez d'irradiation UV ou les cellules utilisent qui n'expriment pas la protéine d'intérêt 14. L'image du gel des produits de PCR (étape 13.4) devrait montrer une gamme de taille qui correspond à la fraction d'ADNc (haute, moyenne ou faible) purifié à l'étape 11.4 (Figure 4, voies 4-6). Notez que les amorces PCR P3Solexa et P5Solexa introduire un supplémentaire 76 nt à la taille de l'ADNc. Si aucun anticorps n'est utilisé pendant l'immunoprécipitation, aucun produit correspondant PCR devrait être détectés (figure 4, pistes 1-3). Produit dimère Primer peut apparaître à environ 140 nt. Pour obtenir des résultats représentatifs de séquençage à haut débit et des analyses ultérieures bioinformatiques voir 14. Figure 1. Représentation schématique du protocole de iClip. Protéines-ARN sont des complexes de liaisons croisées covalentes in vivo en utilisant l'irradiation UV (étape 1). La protéine d'intérêt est purifié avec l'ARN lié (étapes 2-5). Afin de permettre une séquence-spécifique d'amorçage de la transcription inverse, un adaptateur ARN est ligaturé à l'extrémité 3 'de l'ARN, tandis que l'extrémité 5' est marquée radioactivement (étapes 6 et 7). Réticulé complexes protéine-ARN sont purifiés à partir d'ARN gratuitement en utilisant SDS-PAGE et transfert sur membrane (étape 8). L'ARN est récupéré à partir de la membrane en digérant les protéines à la protéinase K laissant un polypeptide restant à la réticulation de nucléotides (étape 9). La transcription inverse (RT) tronque le polypeptide restant et introduit deux régions adaptateur clivables et des séquences de codes à barres (étape 10). Sélection taille supprime sans apprêt RT avant circularisation. La linéarisation suivante génère des modèles appropriés pour l'amplification par PCR (étapes 11-15). Enfin, séquençage à haut débit génère lit dans lequel les séquences de codes à barres sont immédiatement suivis par le dernier nucléotide de l'ADNc (étape 16). Depuis ce nucléotide localise une position en amont du nucléotide réticulé, le site de liaison peut être déduite à haute résolution. Figure 2. Autoradiographie d'réticulé hnRNP C-ARN complexes en utilisant l'électrophorèse sur gel dénaturant et transfert sur ​​membrane. hnRNP C-ARN étaient complexes immuno-purifié à partir d'extraits cellulaires utilisant un anticorps contre hnRNP C (α hnRNP C, les échantillons 3 et 4). L'ARN a été partiellement digéré avec faible (+) ou haute (+ +) concentration de RNase. Complexes déplacer vers le haut de la taille de la protéine (40 kDa) peuvent être observés (échantillon 4). Le décalage est moins prononcée lorsque de fortes concentrations de RNase ont été utilisés (échantillon 3). Le signal radioactif disparaît lorsque aucun anticorps a été utilisé dans l'immunoprécipitation (échantillons 1 et 2). Figure 3. Schéma 6% TBE-urée gel (Invitrogen) pour guider l'excision des produits iClip ADNc. Le gel est géré pendant 40 min à 180 V conduisant à un modèle de migration reproductible des ADNc et des colorants (la lumière et bleu foncé) dans le gel. Utilisez une lame de rasoir pour couper (ligne rouge) du haut (H), moyenne (M), et faible (L) des fractions d'ADNc. Commencez par couper au milieu du colorant bleu clair et immédiatement au-dessus de la marque sur la cassette de gel en plastique. Diviser les fractions moyennes et basses et les garnitures de la fraction haute d'environ 1 cm au-dessus du colorant bleu clair. Utilisez des coupes verticales guidé par les poches et le colorant de séparer les différentes voies (dans cet exemple 1-4). La voie de marqueur (m) peut être teinté et imagé pour contrôlertailles après la coupe. Fragment tailles sont indiquées sur la droite. Figure 4. Analyse des bibliothèques iClip amplifiée par PCR d'ADNc en utilisant l'électrophorèse sur gel. L'ARN récupéré de la membrane (figure 1) était une transcription inverse et la taille purifié par électrophorèse sur gel dénaturant (figure 2). Trois fractions granulométriques de l'ADNc (haute [H]: 120-200 NT, moyenne [M]: 85-120 nt et basse [L]: 70-85 nt) ont été récupérés, circularisé, re-linéarisé et amplifiée par PCR. Les produits de PCR de la distribution de tailles différentes peuvent être observées en raison des différentes tailles des fractions d'entrée. Depuis l'amorce de PCR introduit 76 nt à l'ADNc, tailles devrait se situer entre 196 à 276 nt pour élevée, de 161 à 196 nt pour les moyennes et 146-161 nt pour des fractions de faible taille. Les produits de PCR sont absents lorsque aucun anticorps a été utilisé pour l'immunoprécipitation (pistes 1-3).