Estudiar la base neural de la conducta adaptativa Locomotor en insectos

1. La superficie de paso La superficie que camina negro se compone de dos placas de metal de níquel recubierto de forma permanente se unió al lado del otro y eléctricamente aisladas entre sí por una franja de 2 mm de ancho de 2-componente adhesivo epoxi (UHU plus, UHU GmbH, Alemania) directamente debajo del eje longitudinal del el animal. Que producen una superficie total de 13.5×15.5cm (Figura 1). La separación de los planos medio de las piernas izquierda y derecha permite el control independiente de contacto tarsal de una sola pierna en cada lado. La placa se lubrica con una mezcla de glicerina / agua en una proporción de 95 partes de glicerina a 5 partes de NaCl saturado de solución para transmitir deslizamiento y conductividad eléctrica, la viscosidad es de aproximadamente 430cStokes (Shankar y Kumar, 1994). La mezcla se aplica directamente sobre la superficie y se dispersa con un trozo de tejido blando para asegurar un espesor total de 0.1-0.2mm. 2. Configuración de la estimulación óptica Episodios son provocados caminar usando dos proyectores según lo descrito por Scharstein (1989) para proyectar un patrón de rayas en dos rondas, pantallas de cristal esmerilado (diámetro 130 mm, pantallas Marata, Linos Photonics, Göttingen, Alemania) que se colocan a una distancia de aprox. 70 mm de los ojos, y en un ángulo de 45 ° en la parte delantera izquierda y derecha de la placa (Fig. 1). La longitud de onda del diseño a rayas se mantiene constante en λ = 21 °. La frecuencia de cambio de los estímulos en movimiento puede variar entre 0,35, 0,72, 1,07 y 1.49Hz. Ya que la reacción de los animales depende sólo de la frecuencia ω contraste / λ (ω = velocidad angular, λ = longitud de onda patrón) si el patrón de cambio es lo suficientemente alta (Fermi y Reichhardt, 1963), que no varió a lo largo de los experimentos λ . La luminancia de las rayas brillantes en la parte del animal es de aproximadamente 15cd/m2 y el contraste 0,8. El ojo compuesto de los insectos palo (Carausio morosus) tiene 24 omatidios en el eje dorso-ventral (Friza, 1928) y algunos más en el eje rostro-caudal. A medida que el ángulo de divergencia del ojo de un insecto palo es en promedio de 6,2 ° (Jander y Volk Henrichs, 1970) nuestra longitud de onda patrón fue de aproximadamente 4 veces el ángulo de la omatidios. Los experimentos se configuran en una jaula de Faraday oscuro y se realizó en un cuarto oscuro a 20-22 ° C. Caminar hacia adelante es inducida por un patrón progresivo en ambas pantallas, donde las rayas en cada pantalla se mueven hacia el exterior, o de un solo rayo negro sobre fondo blanco situado entre las pantallas De giro es inducida por las rayas en movimiento en la misma dirección en ambas pantallas. No hemos encontrado una correlación entre la velocidad de las bandas en movimiento y el ángulo de la curva. Una vez que la luminancia del patrón de rayas se fija para inducir a caminar, por lo general no se precisa ningún ajuste adicional, pero se puede ajustar para diferentes animales, según las necesidades de la tensión de las lámparas de halógeno de los proyectores. 3. Preparación de los animales de experimentación Mujer insectos palo adulto (Carausio morosus) se pegan (cemento dental, ProTempII, 3M ESPE, Seefeld, Alemania) con la parte ventral hacia abajo sobre una delgada vara de balsa (3x5x100mm, WxHxL), que se inserta en un tubo de latón que tiene varios conectores. El animal se lleva a cabo durante aproximadamente un minuto hasta que la cola es por lo menos parcialmente endurecidos. La cabeza y las piernas sobresalen de la parte frontal y lateral de la varilla para permitir su libre circulación. El área de las coxas de todas las piernas, así como la mayor parte del abdomen tiene que ser dejado libre de pegamento. Cabeza de insecto, el tórax y los extremos distales de cada fémur y la tibia están marcados con pigmentos fluorescentes (Dr. Kremer Farbmühle, Aichstetten, Alemania) se mezcla con cemento dental para el seguimiento de video más tarde. 4. La colocación de electrodos EMG La actividad muscular de los músculos de la pierna diferente, como en este ejemplo, el transportador de ángulos y músculos retractores coxas, que se encuentran en el tórax y la prolongación causa (movimiento hacia adelante) y retracción (movimiento hacia atrás) de la pierna, se registra por medio de electrodos de EMG implantado en el tórax. Todos los registros de EMG son diferencialmente amplificadas. La señal fue amplificada 100 veces en un pre-amplificador (electrónica taller, Instituto Zoológico, Colonia), la banda de filtrado paso-, (100Hz-2000Hz), amplificada (10x), e importados a través de un convertidor AD en Spike2 (Vers.5.05, CED, Cambridge, UK). Los electrodos están hechos de cables de cobre recubiertos (ELEKTRISOLA, Eckernhagen, Alemania; diámetro exterior 47μm). Para uno de los electrodos, dos cables son los primeros untado con pegamento, entonces, los dos hilos pegajosos están trenzados uno alrededor del otro En un extremo de los extremos de hilos trenzados se sueldan a un mini-plug. En el otro extremo de los cables se cortan los extremos para proporcionar limpio sin aislamiento para la inserción en el animal. Los electrodos de EMG son Plugged en el conector pequeño en el extremo del tubo de latón. Un pin minuten se usa para perforar orificios en la cutícula Los extremos cortados de los electrodos se separan y se inserta en un músculo de aproximadamente 1 mm de distancia el uno del otro, que, en nuestra experiencia, da una buena señal-ruido. Se debe tener cuidado de no introducir los electrodos demasiado profunda en el músculo con el fin de evitar su daño. La figura 2 muestra la ubicación de los electrodos en el tórax del animal. La Figura 3 muestra un animal con los cables de electrodos en su lugar. Nosotros usamos una pequeña gota de pegamento histoacrylic (3M Vetbond, San Pablo, MN, EE.UU.) para mantener los cables en su lugar. Un cable de tierra se introduce en el abdomen. 5. Grabación del contacto del tarso Contacto del tarso se registra siempre en conjunto con los rastros de EMG. Puesto que la superficie resbaladiza se divide en dos mitades, un máximo de dos contactos del tarso contralateral pueden ser registrados en el mismo tiempo. Para ello, la pierna se utiliza como un "interruptor" para cerrar un circuito entre la placa y el amplificador. La corriente puede ser aplicada a las placas por separado a través de dos tomas de corriente en la base de cada plato. Podemos generar dos señales de onda cuadrada con 2-4mV amplitudes con un generador de pulsos (modelo MS501, electrónica taller, Instituto Zoológico, Colonia) que son de fase retrasada en 90 °. Las señales son atenuadas por 60dB (/ 1000) y aplicado a las dos mitades de la superficie resbaladiza. En este experimento se usan sólo una de las dos señales. Es a la vez alimenta a un lock-in-amplificador como una señal de referencia. El lock-in amplificador de dos fases (la electrónica del taller, Instituto Zoológico, Colonia) de forma selectiva sólo amplifica las señales de la misma frecuencia y fase que la señal de referencia siempre. Un segundo canal sólo detecta la señal · Fase 90 retraso. Las señales de ruido en las frecuencias que no sean la referencia de frecuencia son rechazados y no afectan la medición. La señal de salida del amplificador se alimenta a un convertidor AD (1401k Micro II, CED, Cambridge, Reino Unido) y Spike2 digitalizadas utilizando. Entre la toma de contacto y de elevación inicial del tarso en y desde la superficie resbaladiza, la corriente fluye a través de la placa tarso y la tibia en el alambre de cobre (ver a continuación: 5.3 a 5.8). El amplificador elegido tiene una alta resistencia de entrada (1MΩ) y el voltaje de la señal es muy pequeña con el fin de no afectar el comportamiento de caminar del animal. La corriente que circula por el tarso y la tibia es de entre 2 y 4NA. El plazo de entrega de señal durante la toma de contacto, entre la entrada en el lubricante y el contacto con la superficie es menor que 1 ms. La transición de la señal de contacto durante el despegue es menos pronunciada y más retraso. Esto se debe a la ruptura tardía del lubricante del tarso por un efecto de capilaridad y debido al movimiento de la pierna, sin completar el despegue en la fase de impulsión. El tubo de latón con el palo de balsa a la que se pega el animal se introduce en un micromanipulador para permitir el ajuste de altura del animal a entre 7 y 12 mm por encima de la superficie resbaladiza, lo que corresponde a la altura durante la marcha libre. A fin de medir el flujo de corriente cuando el tarso del insecto de la pierna se supervisa en el suelo, un cable (47μm de diámetro) se corta en trozos de aproximadamente 15 cm de largo. El aislamiento de una de cobre se elimina por la quema de la basura con el alcohol. Un bucle se forma con un extremo del cable y se deslizó sobre el tarso de los animales El lazo se ata en el extremo distal de la tibia de un buen contacto entre el animal y el alambre. El cable se fija en el tórax del animal con una gota de pegamento de dos componentes (ProTempII, véase más arriba), y se conecta al amplificador diferencial a través de una pinza de cocodrilo. Para mejorar la conductividad del cable en sus extremos, una gota de crema de electrodo se aplica (Marquette Hellige, Freiburg, Alemania) en las áreas de contacto. La intensidad de la señal y luego se examina en el monitor. Debido a las propiedades del filtro de paso bajo del lock-in-amplificador (10 ms de tiempo constante) y la lift-off/touch-down gradual del tarso, la señal no es una señal cuadrada exacta. Uno tiene que fijar umbrales adecuados cerca del punto de transición para determinar el momento exacto del contacto del tarso y comprobar manualmente cada caso determinado por el software de digitalización. Con base en el contacto del tarso, que define el momento en el tarso de una pierna que se dio fue en el suelo como la posición y el momento en que estaba en el aire como la fase de impulsión. La señal de disparo de la cámara se graba al mismo tiempo con el seguimiento de EMG y la señal de contacto del tarso, y permite un marco preciso de correlación del marco de la conducta y las huellas registradas. 6. Grabación óptica del movimiento de las piernas para el Análisis Digital La frecuencia de intensificación de los insectos palo en superficies resbaladizas puede alcanzar los 3-4 Hz (Graham y Cruse, 1981). Antes de grabar secuencias de a pie, se coloca un espejo en un ángulo de 45 ° detrás del animal para tener un monitor adicional visual para la toma de contacto. La cámara se activa el exterior y las imágenes se introducen en un PC a través de una interfaz FireWire. Grabamos caminar secuencias de arriba con una cámara de video de alta velocidad (Marlin F-033C, Allied Vision Technologies, Stadtroda, Alemania) a 100fps para analizar los movimientos de las piernas de forma digital, y se correlacionan con la actividad de EMG y el contacto del tarso. Durante la grabación de las secuencias de a pie, el animal se ilumina con azul matrices de LED (30-50V DC, 24cd luminancia, Electrónica Taller, Instituto de Zoología de la Universidad de Colonia), que se ajustan en la intensidad para iluminar los marcadores fluorescentes. De acuerdo con la literatura (Schlegtendal, 1934), los insectos palo no poseen visión en color y no hemos observado un efecto adverso de la iluminación de la luz ultravioleta sobre la respuesta de inflexión. Un filtro amarillo en el frontal de la lente de la cámara suprime la corta longitud de onda de la luz de activación y da un mayor contraste para las grabaciones de vídeo. Los archivos de video pueden ser analizadas utilizando software de seguimiento de movimiento (WINanalyze, Vers.1.9, Mikromak servicio, Berlín, Alemania). 7. Grabación de las secuencias de Ruta Como control, en primer lugar una secuencia de a pie con un animal intacto se registra. La velocidad del patrón de rayas está establecido, y el patrón y la grabación de vídeo se inicia aproximadamente al mismo tiempo. Si el animal no se inicia la locomoción espontánea, puede ser estimulado en el abdomen con un cepillo (Bassler y Wegener, 1983), o por un soplo de aire a las antenas. En este caso, los animales tocado en el lado izquierdo del abdomen tienden a girar a la izquierda y viceversa. El patrón de rayas es mantenerse en movimiento hasta que el animal deja de caminar o hasta que al cabo de 3 minutos de grabación continua. Con el fin de probar hasta qué punto la actividad muscular en una pierna depende de la información sensorial de las piernas de vecinos, el animal es inducido a autotomize sus piernas. El sitio de autotomía se cierra de forma natural en cuestión de segundos. Un ejemplo de un animal con el frente y las patas traseras autotomized se muestra en la Figura 3. Por ejemplo, para los experimentos con animales que tienen una sola pierna medio, nos induce autotomía de las patas a favor y en metathoracic apretando el fémur proximal con un par de pinzas (Schmidt y Grund, 2003) o cortar las piernas a nivel de las coxas después de la grabación de los animales intactos. Después de que un mínimo de 30 minutos de tiempo de recuperación se da a los animales. Luego grabamos nuevas secuencias de caminar como antes. En los preparativos reducida, a menudo la necesidad de inducir a pie con trazos de pintura del pincel. 8. Los resultados representativos: Figura 1 Montaje experimental; A:. Fotografía de un insecto palo atado por encima de la superficie resbaladiza, marcado con pigmentos fluorescentes para el seguimiento de la pierna y por cable para la grabación de EMG y medición sin contacto del tarso. B: diagrama de cableado para la grabación de doble contacto tarsal pierna al caminar sobre la superficie resbaladiza. Figura 2. Posiciones para la colocación de los electrodos de EMG en los músculos transportador y el retractor en el tórax de la pierna palo medio de insectos. ML: pierna medio, FL: frente a la pierna . Figura 3 insecto palo con alambres de EMG en los músculos a favor y retractor de la pierna media en el lugar, las patas delanteras y traseras se han quitado para estudiar el efecto de la presencia de las piernas de vecinos de la cinemática y la actividad muscular de las piernas en el medio la preparación reducido. Figura 4. Rastro Ejemplo de retractor actividad EMG con señal de referencia de contacto tarsal en una pierna dentro de media durante el giro. En el inicio de la traza (caja azul primero) el retractor está activo durante el apoyo, mientras que la pierna tiene contacto con el suelo ("circuito cerrado"), lo que indica que el partido de ida hace hacia delante pasos, después de un cambio a corto (caja azul segundo), la retractor está activo durante el swing, mientras que la pierna está en el aire ("circuito abierto", tercera caja azul), que muestra la existencia de pasos hacia atrás indica. Figura 5. Captura de pantalla de una grabación del transportador (trazo superior) y el retractor (en el centro de seguimiento) los músculos y al mismo tiempo la huella grabada en contacto tarsal (traza inferior). Tenga en cuenta la actividad alterna en las huellas de EMG, que corresponde a la actividad de los dos músculos en el ciclo de paso, que es la actividad de un transportador justo antes y duranteswing, cuando la huella de contacto del tarso señales de pérdida de contacto con el suelo, y la actividad retractor durante y después de la toma de contacto del tarso, cuando la pierna está en posición. El inserto muestra el archivo de vídeo juego correspondiente a esta grabación que se utiliza para verificar el comportamiento del animal.